蜂毒肽与变构hIL－2融合基因原核表达载体的构建

目的构建蜂毒肽与人变构白细胞介素－2原核表达载体,为进一步研究该融合基因而奠定基础。方法以本室构建质粒pGEX－4T-2／Melittin－IL－2（^88Arg）为模板,设计引物,用PCR定点突变的方法将IL-2部分的^125Cys突变为Ala,PCR产物与pMD18-T连接,转化大肠杆菌,小提质粒,DNA测序后再将目的片段连接于pET-15b,最后酶切鉴定。结果PCR产物542bp,构建质粒双酶切、DNA测序鉴定如预期。结论成功构建蜂毒肽与人变构白细胞介素-2原核表达载体。     

蜂毒肽在不同溶剂系统中的稳定性研究

该实验研究了蜂毒肽在不同溶剂(水、脱氧水、生理盐水、磷酸缓冲盐溶液、50%乙醇、乙醇、丙三醇)中的稳定性,发现蜂毒肽在50%乙醇中较在水、脱氧水、生理盐水、磷酸缓冲盐溶液中稳定,与乙醇、丙三醇相比,可完全溶解蜂毒中的蜂毒肽,故选择50%乙醇作为蜂毒肽短期储备的储存溶剂;考察了蜂毒肽受光照、温度、p H的影响,以及在不同浓度磷酸缓冲盐溶液、不同p H磷酸缓冲盐溶液和大鼠皮肤匀浆液中的稳定性,结果表明蜂毒肽不受光照、温度、p H的影响,在低浓度、低离子强度溶液中降解加快,在磷酸缓冲盐溶液中随着p H升高降解加快,在大鼠皮肤匀浆液中加速了降解,为选择影响蜂毒肽稳定性小的实验条件提供了实验依据。     

重组蜂毒肽对C6胶质瘤细胞的抑制作用及对 VEGF,Flt-1,MMP-9表达的影响

目的： 探讨重组蜂毒肽作用于大鼠C6胶质瘤细胞后,对细胞生长的抑制作用及对血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子受体（Flt-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响。方法： 对大鼠C6胶质瘤细胞进行体外培养后,分为对照组及重组蜂毒肽低、中、高剂量治疗组,治疗组分别给予相应浓度的重组蜂毒肽（20,50,80 mg·L^-1）,采用MTT法于24,48,72 h分别测定C6胶质瘤细胞的生长情况;并采用Western blot法测定不同浓度重组蜂毒肽作用72 h后C6胶质瘤细胞VEGF,Flt-1,MMP-9的表达情况。结果： 与对照组比较,不同浓度的重组蜂毒肽作用于细胞24 h后,细胞生长情况无明显变化,但48,72 h后,低、中、高浓度治疗组的细胞的增殖活性均有不同程度的降低、生长抑制率增高（P<0.01或P<0.05）;同时中、高浓度重组蜂毒肽作用72 h后,胶质瘤细胞的VEGF,Flt-1,MMP-9表达水平均有不同程度的降低（P<0.01或P<0.05）。结论： 重组蜂毒肽对C6胶质瘤细胞的生长和VEGF,Flt-1,MMP-9的表达均有明显的抑制作用,因此重组蜂毒肽可能通过抑制VEGF,Flt-1,MMP-9的表达来抑制胶质瘤的生长。     

蜂毒肽对类风湿关节炎模型大鼠患侧关节的影响

 目的 探索蜂毒主要成分蜂毒肽对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)模型动物患关节的保护效果.方法 以40只雄性SD大鼠为研究对象,随机分为蜂毒组(Bv)、蜂毒肽组(Me)、盐水对照组(Mn)和假模型组(Nn).前三组在足掌部向足尖注射完全福氏佐剂诱导RA模型,Nn 组相同位置注射生理盐水,之后于患侧足三里4组分别注射蜂毒、蜂毒肽、生理盐水和生理盐水治疗.定期测量关节厚度、缩足逃避反射时间.结果 注射完全福氏佐剂4d后患侧关节均出现关节肿胀,而Nn组无明显变化.观察至笫12天时Me组、Bv组关节厚度明显低于Mn组,方差分析显示差异显著(P＜0.05),这一趋势一直持续至实验结束.各组缩足逃避反射时间在实验开始时基本一致,但在造模后的笫一次观察(第6天)就可以发现Me、Bv、Nn的缩足逃避反射时间都高于Mn组,方差分析显示差异显著(P＜0.05),这一趋势一直持续至实验结束.结论 通过蜂毒肽与全蜂毒对治疗RA效果的全面比较,证实蜂毒肽是蜂毒治疗RA的活性成分.     

葡萄多组分重组囊泡的制备及其载多肽性能研究

目的分离葡萄不同组分并重组构建功能囊泡,考察其装载多肽类药物的性能。方法采用乙醇为溶剂提取葡萄多酚(GP),通过单因素和正交试验优化GP的提取工艺。大孔树脂吸附法纯化GP。正交试验考察蜂毒肽(Mel)与GP的复合条件,制备纳米复合物(GPMC)。蔗糖密度梯度离心法提取葡萄囊泡(GDVs),用于装载优化的GPMC,得到GPMC-GDVs。考察GPMC-GDVs在PBS、DMEM、10%FBS中的稳定性。MTT法评价其对SMMC-7721及Hep G2细胞的毒性。结果优化的GP提取工艺:60%乙醇为提取溶剂,料液比1∶10,提取温度50℃,提取50 min,提取2次。GP纯化条件:4 mg/m L GP粗提物上样7 BV(树脂床体积),水洗5 BV,60%乙醇洗脱5 BV。GPMC-GDVs制备工艺:室温下,将0.4 mg/m L GDVs缓慢滴入等体积含Mel质量浓度为2 mg/m L的GPMC溶液中,孵育30 min。制备的GPMC-GDVs在PBS、DMEM、10%FBS中稳定性良好。MTT结果显示,GPMC-GDVs具有明显的肿瘤抑制作用。结论通过对GP与GDVs组分的分离重组,可制备含药囊泡,并能用于活性多肽的装载,在多肽类药物递送和抗肿瘤领域具有较好的应用前景。     

去唾液酸糖蛋白受体单链抗体靶向蜂毒肽的体外抑瘤效应研究

目的探讨抗去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单链抗体C1与蜂毒肽(Melittin)重组蛋白C1M靶向抑制肝癌细胞的效果。方法将含C1M/pGC的XL1-Blue转化菌通过IPTG诱导表达。表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫组织化学技术分析重组蛋白C1M的抗原结合能力,四氮唑盐(MTT)法检测C1M对肝癌细胞株HepG2的增殖抑制作用。结果原核表达质粒C1M/pGC在XL1-Blue中获得有效表达;表达产物以可溶性形式存在;纯化的C1M相对分子量为29.4×103;免疫组化结果表明C1M能有效识别去唾液酸糖蛋白受体,与HepG2(C1M)共培养3d,细胞生长抑制率达92.0%。结论在大肠埃希菌中成功表达C1M,位于C端的Melittin蜂毒肽能有效抑制肿瘤细胞的生长,为体内研究Melittin的靶向抗肝癌效果奠定了基础。     

蜂毒肽在治疗炎性疾病中的研究进展

炎性疾病是指因过度炎症反应所引发的或伴有炎症并发症的一类可影响人类健康的病症。目前临床上可通过抑制炎症反应达到治疗炎性疾病的目的,而常用的抗炎药虽然疗效明确,但都存在明显的不良反应,易给机体造成二次伤害,故抗炎新药亟待开发。蜂毒肽是从蜂毒中分离出的主要有效成分,具有较强的抗炎活性,其可通过介导炎症通路信号传递、抑制炎症细胞活性及炎症介质分泌等途径治疗多种炎性疾病,且疗效较好,具有较为广阔的临床应用前景。本文主要对蜂毒肽在治疗不同炎性疾病中的作用特点、蜂毒肽主要不良反应及应对策略进行了总结,以为后期蜂毒肽抗炎应用的临床开发提供参考。     

蜂毒肽抗炎作用及机制的研究进展

炎症是一种普遍现象,由先天性和获得性免疫系统触发,以维持体内稳态.这种现象通常会起到限制感染和修复损伤的作用,但是如果没有适当地分阶段进行,炎症可能会导致免疫功能异常.蜂毒是蜜蜂用来防护的毒素,数百年来,它已在东方用作抗炎药,用于治疗慢性炎性疾病.目前,越来越多的学者致力于蜂毒的主要成分蜂毒肽抗炎作用的研究,为其临床应...     

一种新型肝癌免疫毒素的表达、纯化及初步鉴定

从噬菌体随机肽库中筛选获得了与肝癌细胞特异性结合的12-肽A54,将其与蜂毒肽(melittin,Mel)编码基因连接后,插入质粒载体pET-32a(+)中,构建成A54-Mel与硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)及六聚组氨酸(6×His)的融合表达载体pET32-A54-Mel。将重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达后,获得可溶性表达产物,经Western blot鉴定,表达产物能与蜂毒肽特异性抗体反应。表达菌经超声裂解后,上清液用Ni+离子亲和层析法纯化得到了融合蛋白(Trx-A54-Mel),经肠激酶裂解、再次Ni+离子亲和层析后得到纯度大于95%的肝癌特异性免疫毒素A54-Mel。经细胞ELISA和四氮唑盐(MTT)法检测,发现A54-Mel在体外具有一定的肿瘤细胞特异性靶向及杀伤活性,为新型免疫毒素在肝癌靶向治疗中的研究奠定了基础。     

蜂毒肽Mastoparan诱导大鼠小脑颗粒神经元死亡的机制

目的 研究蜂毒肽ｍａｓｔｏｐａｒａｎ（ＭＰ）通过改变细胞内钙离子浓度（［Ｃａ＾２＋］ｉ）诱导大鼠小脑颗粒神经元死亡的机制。方法 测定原代培养神经元的存活率；用Ｆｕｒａ－２／ＡＭ荧光比值成像技术测定［Ｃａ＾２＋］ｉ。结果 ＭＰ剂量依赖性地诱导小脑颗粒神经元死亡，并触发［Ｃａ＾２＋］ｉ升高。移去细胞外钙，或使用电压依赖性Ｃａ＾２＋通道阻滞剂尼莫地平不能阻断其作用。用ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ预先耗竭１，