铜绿假单胞菌lasR基因反义肽核酸序列筛选及其抑制生物被膜形成的研究

目的 筛选靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸序列,探讨其对铜绿假单胞菌的生物被膜形成能力的影响.方法 针对铜绿假单胞菌lasR基因设计4条反义寡核苷酸序列,利用斑点杂交筛选出与lasR基因结合最佳的反义寡核苷酸序列,以此合成与穿膜肽连接的肽-肽核酸序列.分别用不同浓度的肽-肽核酸导入铜绿假单胞菌生物被膜模式菌PAO1中,测定不同时相点细菌生长光密度[D(600)]值并进行菌落计数,观察肽-肽核酸对其生长的抑制作用.利用光学显微镜和扫描电镜观察生物被膜形成情况.qPCR方法检测lasR mRNA表达.结果 斑点杂交实验结果显示:4条反义寡核苷酸序列中3条有杂交信号产生,其中第1条序列信号最强,以此为基础合成反义肽核酸.不同浓度的肽-肽核酸对铜绿假单胞菌表现出不同程度的体外抗菌活性,且随着浓度增加,抗菌活性增强.结论 有效筛选出高效反义核苷酸序列,经筛选出的靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸对铜绿假单胞菌的生长及生物被膜形成能力有明显抑制作用,同时抑制lasR mRNA的表达.     

基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱分析多态性遗传标记

随着人类基因组测序工作的完成，多态性遗传标记及其检测手段日益受到重视。基质辅助激光解吸／离子化飞行时间质谱作为一种高通量的单核苷酸多态性分型技术受到关注，它不仅可以分析单核苷酸多态性，还可以进行微测序、分析短串联重复序列。目前的分析方法有：引物延伸法、连接酶反应法、肽核酸法、侵入法等。     

Ugi四组分缩合反应合成肽核酸单体

目的为了改善肽核酸的理化和生物学性质，对经典肽核酸的结构进行衍生化和修饰。方法采用Ugi四组分缩合反应进行PNA单体的合成并采用Fmoc的保护策略。结果合成了Fmoc保护的PNA单体和关键组分异腈。结论建立了一种简单，灵活多变的合成PNA单体的方法。     

肽核酸探针在生物传感器检测中的研究进展

利用生物传感器进行病原微生物的快速检测是近年发展起来的新型检测技术，生物传感器是生物活性材料（如酶、蛋白质、DNA、抗原、抗体、生物膜等）与物理化学换能器有机结合的一中新型检测装置，其原理是利用生物识别和生物学反应，产生的信息被物理或化学换能器转变成可定量和可处理的电信号，且信号的强度与靶标物的浓度成正比比例。     

反义Ki-67肽核酸对裸鼠人肾癌细胞移植瘤的治疗作用

目的:探讨Ki-67基因反义肽核酸(AS-PNAs)在体内对小鼠人肾癌移植瘤Ki-67表达和肿瘤生长的影响.方法:建立人肾癌移植瘤裸鼠模型,瘤体内注射反义肽核酸(AS-PNAs),定期测量肿瘤体积,处死小鼠后采用免疫组化、Western blot检测肿瘤Ki-67抗原表达,原位末端标记法(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡,并与反义寡核苷酸(AS-ODN)处理组对照.结果:AS-PNAs处理组肿瘤生长受押(513.2±64.2)mm3,Ki-67表达下降(23.0±2.4)%、(59.7±2.3)%,细胞凋亡增加(31.1±2.0)%,与AS-ODN处理组(868.9±128.2)mm3、(33.6±2.6)%、(85.7±4.4)%、(18.3±2.3)%比较差异有显著性(P＜0.01).结论:反义Ki-67肽核酸能抑制小鼠人肾癌移植瘤Ki-67基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长,且优于反义寡核苷酸.     

第三代反义核酸技术——肽核酸

肽核酸是一种人工合成的DNA分子的类似物,被称之为第三代反义核酸,是目前反义核酸技术领域研究的前沿和热点.本文简要叙述了肽核酸的分子结构、理化性质和杂交特性以及肽核酸在基因表达调控、分子生物学实验研究和疾病基因治疗研究等方面的应用情况.     

阳离子脂质体介导肽核酸转染K562细胞的研究

目的 优化阳离子脂质体介导肽核酸(PNA)转染K562细胞的条件.方法 以阳离子脂质体lipofectamine 2000为载体,将标记有FITC荧光基团的PNA转染K562细胞,在荧光显微镜下观察并计算其转染效率,采用Cell Counting Kit(CCK-8)检测其细胞毒性.应用正交试验筛选出最佳的PNA和脂质体的用量及比例,并优化稀释用培养基血清浓度,以获得最优的转染效果.结果 以2.5× 105/mL～3×105/mL的细胞密度接种,100 μL/孔的培养基中加入PNA 6.25 pmol,PNA与脂质体的体积比为1∶3.5,稀释用培养基未加胎牛血清时,细胞转染效率和细胞毒性最佳,转染效率为87.2％,细胞存活率(RGR)为94.1％.结论 PNA可通过阳离子脂质体转染进入K562细胞,优化条件后得到的细胞转染效率和细胞存活率能够满足基因表达研究的实验要求.     

肽核酸钳制PCR技术在结肠癌K-Ras基因突变检测中的优化

目的优化建立一种敏感、简便、稳定地检测结肠癌患者K-Ras基因突变的方法。方法构建K-Ras基因第二外显子12、13密码子的野生型及突变型质粒,通过优化PCR及肽核酸与特异性引物的浓度关系,达到有效模板浓度低的样品K-Ras基因突变的检测。结果成功构建K-Ras基因第二外显子12、13密码子的野生型和突变型质粒。肽核酸钳制PCR条件优化包括：（1） 最佳复性温度为58℃和60℃;（2） 有效模板浓度为10-6pg／μl;（3） 引物浓度与肽核酸浓度的最佳比例为20∶1。在K-Ras突变型质粒与野生型质粒浓度比为1∶100时即可检测到突变。结论肽核酸钳制PCR技术较传统的测序方法更为敏感,可以应用于有效模板浓度低的样品,为结肠癌个体化治疗前相关基因检测的有效方法。     

CXCR3、IP10对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的研究CXCR3及IP10对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)凋亡的影响,并对其机制进行初步探讨。方法 HUVEC在高糖和正常糖DMEM培养液中分别培养24h、48h、72h,流式细胞术检测凋亡率,Westernblot检测CXCR3表达。反义肽核酸(asPNA)阻断高糖组细胞表达CXCR3后,Westernblot检测CXCR3表达,流式细胞术检测凋亡率。CXCR3配体IP10及拮抗剂AMG487干预高糖组细胞48h后,流式细胞术检测凋亡率。结果 高糖组48h、72h时细胞凋亡率(22.56±1.83)%、(25.33±2.34)%较对照组(3.01±0.27)%、(3.80±0.32)%增加显著(均为P<001)。高糖组48h、72hCXCR3表达量0.57±0.04、0.87±0.03较对照组48h0.36±0.02、0.71±0.02明显上调(P<0.01、<005)。1μmolL-1asPNACXCR3组、2μmolL-1asPNACXCR3组CXCR3表达量0.32±0.02、0.14±0.02均较空白对照组(0.61±0.02)及阴性对照组(0.59±0.03)显著下降(均为P<0.01)。同时,1μmolL-1asPNACXCR3组、2μmolL-1asPNACXCR3组细胞凋亡率(15.33±1.05)%、(9.00±0.76)%也较空白对照组(22.98±1.92)%及阴性对照组(21.34±1.73)%明眼科新进展 2014年7月 第34卷 第7期显下降(均为P<001)。IP10组细胞凋亡率(38.05±2.88)%较高糖对照组(21.11±2.02)%、IP10+AMG487组(20.80±217)%及AMG487组(19.54±1.93)%显著增加(均为P<0.01)。结论 CXCR3、IP10促进高糖诱导的HUVEC凋亡,其促凋亡机制与IP10/CXCR3轴有关。     

乙肝病毒突变位点的寡核苷酸与肽核酸阵列杂交检测

目的：比较利用寡核苷酸阵列和肽核酸阵列检测乙肝病毒突变位点。方法：针对乙肝病毒常见的1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、 1896G-A 3个突变位点,设计寡脱氧核苷酸和肽核酸检测探针,探针经固定后分别与不对称PCR荧光标记的靶DNA杂交,扫描分析荧光信号强度,DNA序列分析3位点的变异情况。结果：对于寡核苷酸芯片,1762与1764联合位点、1858以及1896位点的野生型探针与突变探针荧光强度的比值分别为1.44、1/1.24、1.05。对于肽核酸芯片,相应位点的野生型探针与突变探针荧光强度的比值分别为2.8、1/3.02、1.71。DNA序列分析结果表明该样本中1858位点为突变位点,1896以及1762与1764联合位点不存在突变。结论：与寡脱氧核苷酸探针相比,肽核酸与靶DNA杂交结合能力和识别单碱基错配能力均高于相应的寡脱氧核苷酸,二者杂交结果与测序结果一致。