~(188)Re标记反基因肽核酸的方法学研究

目的研究^188Re标记反基因肽核酸（AGPNA）的方法及标记物与胰腺癌Patu8988细胞结合内化的特性。方法用^188Re直接标记经修饰的AGPNA,改变标记条件摸索标记方法,在不同时间点（15min-6h）测定标记率;测定标记物加入人血清和生理盐水后不同时间点（15min-24h）的放化纯度;进行胰腺癌Patu8988细胞摄取^188Re-AGPNA的内化实验。结果当标记条件为100μlSnCl2·2H2O（20mg/ml）和20μlAGPNA（2mg/ml）时,^188Re-AGPNA的标记率最高可达（89.99±0.15）%,放射性胶体含量为（9.40±0.55）%。标记物加入血清24h后放化纯度为（89.14±0.63）%。^188Re-AGPNA转染胰腺癌Patu8988细胞的最高细胞结合率为（38.16±2.17）%,最高核内化率为（22.41±0.86）%。结论^188Re直接标记经修饰的反基因肽核酸方法简便、标记率较高,能与胰腺癌细胞结合并转染入细胞核。     

一种新型肽核酸基因传感器阵列检测系统的构建

目的构建针对乙型肝炎病毒(HBV)的肽核酸(PNA)压电基因传感器(PGS)阵列检测系统. 方法设计针对HBV的bis-PNA探针,将其固定在PGS阵列表面,具体摸索了bis-PNA探针与HBV基因组DNA杂交时的最佳pH值、最佳离子浓度、最佳探针固定量,并结合自激式振荡电路,PESA V2.0频率记录分析软件构建出PNA-PGS阵列检测系统. 结果杂交缓冲液pH值为6.8、离子浓度为20 mmol/L、探针浓度为1.5 μmol/L时杂交条件最为适宜. 结论成功地构建出了HBV PNA-PGS阵列检测系统,为临床标本中HBV的直接检测奠定了良好的实验基础.     

肽核酸生物传感器直接检测临床标本中提取的病毒基因组DNA

目的 以肽核酸生物传感器检测系统直接检测从临床标本中提取的乙型肝炎病毒基因组DNA。方法 抽取63例临床免疫学检测证实为乙型肝炎病毒(HBV)感染者标本血清的DNA，以及15例免疫学检测全阴的标本血清中的DNA，分别用肽核酸生物传感器法以及定量PCR法检测，比较两种方法的优劣并确定传感器法的检测限。结果 传感器法检测60例标本阳性，阳性率为95．24％，而定量PCR法检测63例均为阳性；15例阴性血清两种方法检测均为阴性；传感器法的检测限为8．6pg／L；两种方法检测HBV差异无显著性，但传感器检测法所用时间更短，且无需进行探针的标记。结论 利用肽核酸生物传感器成功地绕过了PCR扩增而直接检测出了临床标本中的HBV基因组DNA。     

多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因高效反义肽核酸序列筛选及其体外抗菌活性观察

目的 筛选出能与多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的mRNA紧密结合的反义肽核酸序列,评估其体外抗菌活性.方法 利用Mfold、RNA Structure 4.6两种计算机软件对多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的mRNA进行二级结构分析计算,根据最低自由能原则在其mRNA局部杂交松弛区设计反义寡核苷酸,与体外转录的地高辛标记的gyrAmRNA进行斑点杂交,根据杂交信号的强弱筛选出与gyrA mRNA紧密结合的反义寡核苷酸,根据其序列合成肽核酸(pep-tide nucleic acid,PNA),另加设1条与靶序列有6个碱基错配的PNA作为阴性对照,2条PNA分别连接穿膜肽形成肽-肽核酸(peptide-PNA,PPNA).测定经不同浓度PPNA处理的细菌光密度[D(600)]值并进行平板菌落计数,观察其对细菌生长的抑制作用,采用RT-PCR检测gyrA mRNA的表达水平.结果 斑点杂交结果显示,计算机软件设计的10条反义寡核苷酸探针中有5条与gyrA mRNA显示出杂交信号,其中1条信号最强,能够与gyrA mRNA稳定结合,将其以肽-肽核酸的形式合成处理细菌,结果表明其在5 μmol/L浓度可完全抑制gyrA mRNA的表达,并抑制鲍曼不动杆菌的生长,在10μmol/L浓度具有杀菌活性,而具有错配碱基的PPNA对细菌生长无明显抑制作用.结论计算机辅助设计联合斑点杂交可在体外模拟体内环境对寡核苷酸与靶基因结合的有效性进行验证,实现在体外高通量筛选高效反义序列.经筛选得到的靶向gyrA基因反义肽-肽核酸可在体外高效抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长.     

漏声表面波传感器检测HPV及传感器再生性研究

目的 应用漏声表面波(LSAW)生物传感器实时检测HPV,并对传感器进行再生性研究.方法 每次实验前分别用Piranha液、1 mol/L HCI和1 mol/L NaOH等溶液清洗传感器反应区域,在相同实验条件下,再生使用20次;探讨传感器的信号响应及再生性能.结果 再生使用5次时核酸杂交引起的相当于第1次的89.60%,变异系数为4.24%,再生检测10次时响应信号相当于第1次的71.56%,变异系数为10.14%;再生10次后传感器检测能力开始迅速降低.结论 LSAW生物传感器可以特异性地进行人乳头状瘤病毒(HPV)的快速检测,并具有较好的再生性.     

胰腺细针穿刺活检组织K-ras突变检测的诊断价值

目的 检测内镜超声引导下细针穿刺穿刺物中K-ras基因的突变,探讨其对胰腺癌早期诊断的价值.方法 收集27例胰腺癌、9例其他恶性肿瘤及14例良性胰腺占位患者的细针穿刺物,应用肽核酸(PNA)钳制PCR法检测K-ras突变.结果 胰腺癌患者K-ras突变阳性率为88.9%,其他恶性肿瘤为44.4%,良性胰腺占位为35.7%,胰腺癌与其他两种病变差异显著(P=0.013,P=0.001).胰腺癌与其他恶性肿瘤比较,K-ras基因突变的敏感性、特异性、阳性预测率、阴性预测率、准确率分别为88.9%、55.6%、85.7%、62.5%、80.6%,差异显著(P=0.013);与良性胰腺占位病变比较,分别为88.9%、64.3%、82.8%、75.0%、80.5%,差异亦显著(P=0.001).联合穿刺物细胞学检查和K-ras基因突变检测,胰腺癌的阳性率高达96.3%.结论 胰腺组织穿刺物的K-ras基因突变检测可提高胰腺癌诊断的阳性率.     

应用肽核酸钳制PCR技术检测胰腺癌K ras基因突变

目的:应用肽核酸钳制PCR技术检测胰腺癌Kras基因突变,探讨其诊断价值。方法:结合特异性肽核酸(针对野生型序列)与实时定量PCR技术建立一步Kras基因检测法,与传统限制性片段长度多态性PCR法检测结果进行比较,评价新方法的诊断价值。结果:肽核酸钳制PCR法可同时对胰腺癌标本中Kras基因的第12、13密码子突变情况进行检测,操作简便;可在105倍的野生型Kras基因背景下检测出突变,灵敏度为0.001%,可检测突变基因最低限为102拷贝;该方法可同时进行较大规模的样品检测,单次检测时间仅需1 h。而传统方法可检测的突变基因最低限为103拷贝,检测灵敏度为0.01%;需花费约2 d完成同样数量的样本检测。结论:肽核酸钳制实时定量PCR法较限制性片段长度多态性PCR法有明显优势,适用于胰腺癌大规模临床样本的Kras基因突变检测,可作为胰腺癌筛查的有效手段。     

反义肽核酸阻断CC趋化因子受体5途径延长同种异体胰岛移植物存活

目的:探讨CC趋化因子受体5（CCR5）反义肽核酸对同种异体胰岛移植急性排斥反应的影响。方法:建立小鼠胰岛移植模型用于检测以CCR5为靶位的PNA CCR5在体内对急性胰岛移植排斥的效应。通过混合淋巴细胞培养（MLR）来评估体外T细胞增殖应答能力。应用RT-PCR和Western blot检测mRNA和蛋白表达水平。结果:与生理盐水对照组［(6.5±0.58)d］和随机PNA错配组［（6.5±0.50）d］相比,PNA CCR5处理组有功能胰岛移植物存活时间明显延长［（12.0±1.75）d］（P均<0.01 ）。移植后第7天,PNA CCR5组的CCR5 mRNA表达水平（0.56±0.05）明显低于对照组和错配组（1.68±0.07和1.80±0.14）（P均<0.01）。PNA CCR5组移植物CCR5蛋白水平亦较对照组和错配组明显下降（P均<0.01）。PNA CCR5组小鼠淋巴细胞增殖能力亦明显降低。结论:PNA CCR5能延长同种异体胰岛移植物的存活时间,在抑制同种异体急性排斥反应中具有潜在的治疗效应。     

肽核酸及其类似物的合成方法概述

肽核酸（PNA）作为一种反义核酸类化合物，在分子水平的疾病诊治上，有其独特的优越性，现在日益受到关注。综述了PNA类化合物在基本合成思路和几种主要合成方法，另外还介绍了几种PNA类似物比较特殊的合成方法。     

靶向“圈套”肽核酸对NF-κB活性影响及胆管癌细胞体外抑制作用

NF-κB的异常激活在多种肿瘤细胞的增殖调控中发挥中枢性作用。其以p65／p50异二聚体的形式普遍存在于细胞浆中．可被多种刺激因素激活参与相应靶基因的转录激活与抑制。人胆管癌中NF-κB存在选择性激活．这与胆管慢性炎症的致瘤转化、侵袭、转移、凋亡抵抗等生物学行为有关。应用靶向转录因子“圈套”策略拮抗NF-κB活性抑制炎症因子的超量释放已获得更肯定的疗效，