瘦素对大鼠肝细胞瘦素受体蛋白、基因表达及酪氨酸磷酸化的影响

目的观察瘦素对大鼠肝细胞瘦素受体蛋白、基因表达及酪氨酸磷酸化的影响。方法分离、培养新生Sprague-Dawley大鼠肝脏细胞,与瘦素共同孵育12 h、24 h及36 h,提取蛋白后用Western blot法检测瘦素受体的蛋白水平的变化,用RT-PCR法检测大鼠肝细胞瘦素受体的mRNA水平,用免疫共沉淀法检测瘦素受体的酪氨酸磷酸化程度。结果大鼠肝细胞的瘦素受体的蛋白水平在与瘦素共同孵育12 h、24 h和36 h后与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠肝细胞瘦素受体的mRNA表达在孵育12 h后与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),孵育24 h及36 h后,与对照组及孵育12 h时相比,mRNA水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。经瘦素作用12 h后,对大鼠肝脏细胞瘦素受体酪氨酸磷酸化无显著影响(P>0.05),但孵育24 h及36 h后,大鼠肝脏细胞瘦素受体的酪氨酸磷酸化程度与对照组及瘦素作用12 h后相比均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论瘦素可促进大鼠肝细胞瘦素受体的mRNA表达并增强其酪氨酸磷酸化程度。     

LPS对小鼠肺组织及RAW264.7细胞Akt蛋白表达及磷酸化的调控

目的 探讨脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)在体内外对Akt蛋白表达和磷酸化水平的影响.方法 用不同剂量LPS攻击RAW264.7细胞,检测不同时相点细胞Akt蛋白表达和磷酸化水平.小鼠腹腔注射LPS 6 h 后检测肺组织Akt蛋白表达和磷酸化水平.结果 不同剂量LPS攻击RAW264.7细胞,细胞Akt蛋白表达没有显著差异(P>0.05),磷酸化水平增加.而内毒素血症小鼠肺组织Akt蛋白表达没有显著变化(P>0.05),磷酸化水平减低.结论 LPS在体内外对Akt蛋白磷酸化作用不同,体外Akt蛋白磷酸化水平增高,但在内毒素血症小鼠体内出现Akt蛋白磷酸化水平异常减低.     

少突胶质细胞对PC12细胞JAK2基因表达的影响及其意义

目的 探讨少突胶质细胞对PC12细胞JAK2基因表达的影响及其意义。方法 用分离培养的少突胶质细胞及其细胞碎片分别作用于培养的PC12细胞,于不同作用时相点在观察PC12细胞突起变化的同时检测PC12细胞内JAK2mRNA的表达JAK2蛋白的磷酸化。结果 在给予少突胶质细胞及其细胞碎片处理后10min,JAK2 mRNA表达较对照组有显著增高（P＜0．05）,但处理12h后,其表达虽较处理10min及4h有显著下降,但仍显著高于对照组（P＜0．05）。对照组JAK2蛋白的活性较低,但少突胶质细胞及其细胞碎片加入后,JAK2蛋白很快便被磷酸化而激活,到处理后12h,激活的蛋白呈较处理10min有显著下降,但仍显著高于正常对照组（P＜0．05）。少突胶质细胞及其细胞碎片对其影响差别不显著（P＞0．05）。结论 少突胶质细胞作用于PC12细胞时可调节PC12细胞JAK2的表达与激活,这种表达与激活在一定程度上可能介导少突胶质细胞对PC12细胞突起生长的影响。     

5/6肾切除大鼠早期模型中p38MAPK的动态变化

目的：研究5/6肾切除大鼠模型中p38MAPK磷酸化的动态表达情况。方法：82只雄性SD大鼠分为两组：5/6肾切除模型组72只,假手术对照组10只。模型组造模完成后,分别于肾切除早期（术后1/2h、1h、3h、6h、12h、1d、2d、4d）相应时间点处死,每组9只,假手术组于术后12h处死,称量各组体重及残余肾重,计算肥大指数;下腔静脉取血留取血清测定血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）;以Western blotting免疫印迹法检测肾皮质磷酸化p38MAPK活性的表达情况;以病理光镜和电镜观察肾小球、肾小管及肾间质组织形态学及超微结构的变化。结果：模型组与对照组相比,肾脏呈代偿性肥大,肥大指数增高（P〈0.05）,Scr和BUN升高（P均〈0.01）。免疫印迹法显示5/6肾切除术后1/2h、1h、3h、6h、12h磷酸化p38信号呈递增趋势,尤以12h信号最强,之后信号减弱,2d时几乎不可见,4d有较弱的信号,假手术组未见明显信号。光镜下,发现肾小球有轻度系膜细胞增生,基质增宽不明显,肾小管偶有轻度变性,间质偶有炎性细胞浸润。电镜下,偶见足突局灶融合。结论：5/6肾切除大鼠在造模完成后12h时磷酸化p38MAPK表达最强。     

双硫仑联合铜离子对乐伐替尼耐药肝癌细胞Huh7增殖及凋亡的影响

目的建立乐伐替尼肝细胞肝癌(简称"肝癌")细胞耐药模型,以研究双硫仑联合铜离子对乐伐替尼耐药细胞Huh7增殖和凋亡的影响。方法通过CCK8法检测乐伐替尼作用下Huh7细胞的半抑制浓度(IC50),采用浓度递增法诱导Huh7细胞乐伐替尼耐药。各组细胞处理:对照组为Huh7细胞加普通培养液培养后的细胞;敏感组为Huh7细胞加10μmol/L乐伐替尼培养后的细胞;耐药组为耐药Huh7细胞加10μmol/L乐伐替尼培养后的细胞;联合组为耐药Huh7细胞加10μmol/L乐伐替尼+1μmol/L双硫仑+0.5μmol/L铜离子培养后的细胞;抑制剂组为耐药Huh7细胞加10μmol/L乐伐替尼+10μmol/L Akt抑制剂MK2206培养后的细胞。CCK8法及流式细胞术分别检测细胞的存活率和凋亡率;Western blot法检测磷酸化-Akt(p-Akt)和半胱氨酸蛋白酶9(caspase-9)和B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)蛋白表达;Transwell法检测细胞侵袭性。结果乐伐替尼耐药细胞系成功建立,选取10、20、40、60、80及160μmol/L 6个乐伐替尼浓度对Huh7细胞作用48 h后计算得出细胞IC50为12.35μmol/L。耐药组细胞存活率明显高于敏感组(P<0.01),联合组细胞存活率明显低于耐药组(P<0.01),抑制剂组细胞存活率明显低于耐药组(P<0.05)。与耐药组比较,联合组及抑制剂组p-Akt蛋白表达明显降低(P<0.01)、caspase-9明显升高(P<0.01),而Bcl-2蛋白在耐药组和联合组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。联合组细胞凋亡率明显高于耐药组(P<0.01)。Transwell结果显示联合组的肿瘤细胞侵袭数明显少于耐药组(P<0.01)。结论双硫仑联合铜离子能增加乐伐替尼对乐伐替尼耐药肝癌细胞Huh7的敏感性,同耐药组相比其细胞抑制率明显提高,其机制可能与抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt通路及促进caspase-9蛋白表达有关。     

降钙素基因相关肽减轻局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质tau磷酸化

目的:探讨外源性降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide,CGRP)对局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质tau蛋白过度磷酸化的影响。方法:用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型,应用免疫组织化学SABC法、Western Blotting和图像分析方法检测大鼠顶叶皮质tau蛋白在Ser199/202位点磷酸化程度和总tau蛋白表达、以及CGRP对缺血神经元tau蛋白过度磷酸化的影响。结果:缺血再灌注顶叶皮质tau蛋白在Ser199/202位点磷酸化水平和总tau蛋白显著升高(P<0.05);CGRP组大鼠顶叶皮质tau蛋白在Ser199/202位点磷酸化水平显著低于缺血再灌注组,总tau也降低(P<0.05)。结论:CGRP明显减轻局灶性脑缺血再灌注大鼠顶叶皮质tau蛋白磷酸化程度,降低tau蛋白磷酸化水平可能对缺血神经元起保护作用。     

小鼠肝细胞胰岛素与EGF信号转导磷蛋白质组的动力学行为对比分析

目的分析小鼠肝细胞内胰岛素与表皮生长因子（EGF）信号转导磷蛋白质组的动力学行为差别，以此找出两者关键性的信号蛋白。方法采用双向电泳及放射性同位素标记技术，进行分析比较EGF与胰岛素分别介导的磷酸化蛋白质组的动力学行为。结果参与两者信号转导的磷蛋白质种类没有多大差异，大多数信号磷蛋白磷酸化水平的动力学行为也表现为一致性，但有4个蛋白点其磷酸化水平随时间变化趋势明显不同。结论胰岛素与EGF虽然在多方面有许多相似之处，但在同一细胞内参与信号转导的个别信号蛋白其磷酸化水平的动力学行为差别较大，估计这些蛋白就是导致EGF与胰岛素最终生物学活性有所不同的关键蛋白。     

脊髓缺血再灌注中ERK1／2作用的初步研究

目的:研究细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases1/2,ERK1/2)在脊髓缺血再灌注中的作用及机制.方法:观察不同时间段脊髓缺血再灌注标本的形态学改变,Westem blot检测脊髓标本中ERK1/2的磷酸化,免疫组织化学染色分析磷酸化ERK1/2(pERK1/2)在神经细胞内的定位表达.结果:脊髓缺血30 min/再灌注2 h ERK1/2发生磷酸化,并持续至再灌注24 h;对照组、脊髓缺血30 min/再灌注5 min至再灌注1 h,免疫组织化学染色未检测到pERK1/2在运动神经细胞内表达,脊髓缺血30 min/再灌注2 h至再灌注24 h,pERK1/2在运动神经细胞胞浆及胞核内均表达,且胞浆内表达异常显著.结论:脊髓缺血再灌注时ERK1/2发生磷酸化,pERK1/2过度滞留于细胞浆可能与脊髓缺血再灌注损伤引发的神经细胞凋亡有关.     

磷酸化蛋白质组学技术及其在肿瘤研究中的应用

磷酸化蛋白质组是指机体细胞在特定时间和空间上表达的所有磷酸化蛋白质;磷酸化蛋白质组学是在整体水平上研究磷酸化蛋白质在细胞中的组成成分、表达水平、修饰状态及相互作用规律的学科.近年来,磷酸化蛋白质学技术已广泛应用于肿瘤研究,为阐明肿瘤的发生机制,提高肿瘤的诊治水平提供了重要信息.     

雌激素对阿尔茨海默病大鼠学习记忆及海马神经元损伤保护作用的研究

目的:观察雌激素对阿尔茨海默病(AD)大鼠学习记忆及海马神经元损伤的影响,探讨雌激素神经保护的机制. 方法:选取雌性成年SD大鼠24只,随机分为对照组、AD 雌二醇(E2)组、AD组,每组8只.Morris水迷宫检测大鼠学习记忆功能,苏木精-伊红(H-E)染色及Bielschowski染色法观察海马神经元形态,免疫组化法观察Tau蛋白异常磷酸化变化及GSK-3β活性.结果:与AD组相比,AD E2组大鼠迷宫测试明显改善(P<0.01);海马CA1区神经元纤维形态规则,Tau蛋白磷酸化阳性细胞数明显减少(P<0.01),Tau蛋白表达减少,且GSK-3β总量及磷酸化GSK-3β含量均有所增加.结论:雌激素治疗可改善Aβ诱导的大鼠学习记忆障碍及海马神经元损伤,可能通过作用GSK-3β导致Tau蛋白去磷酸化,从而达到保护神经的目的.