Ⅰ型胶原海绵/血管内皮生长因子缓释系统的初步构建

[目的]研制Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ,CI)海绵/血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)缓释生物支架材料,了解该种材料中的VEGF体外缓释效果.为骨肌腱组织工程寻求一种新型复合支架材料.[方法]从CI海绵自身的力学、孔径、紫外最大吸收光谱、孔隙率、含水率、傅立叶红外光谱及与VEGF的组织相容性等方面研究VEGF胶原缓释系统支架材料的特性,利用生物学方法将VEGF负载于CI,制备具有VEGF缓释效果的复合支架.[结果]CI海绵能够成功的将VEGF包裹起来,可以达到明显的缓释作用,与VEGF有良好的组织相容性.[结论] CI海绵有理想的孔径和合理的生物力学及与VEGF良好的生物学相容性结构性质,VEGF可以从CI - VEGF缓释材料中缓慢释放,有明显的缓释效果,是一种具有良好材料特性的组织工程材料.     

纳米磷酸钙/氧化锆骨组织工程支架体内降解的实验研究

目的研究纳米磷酸钙/氧化锆骨组织工程支架材料体内降解特性,为进一步构建组织工程化纳米人工骨提供研究依据。方法制作兔股部肌袋,将灭菌的纳米磷酸钙/氧化锆骨组织工程支架材料植入肌袋内,在植入4周、8周、12周、16周时取材通过大体、组织学、扫描电镜观察材料降解情况,同时将材料取出后煅烧,测量残余无机物含量,判断降解的量,同时进行X线衍射实验,测量残余材料的组成。结果材料植入8周内降解较慢,生物力学强度减低不明显,12周时降解加速,材料强度明显减低,16周时新骨形成明显,降解残余材料分布于新形成的骨组织内部,X线衍射发现12周时材料内有羟基磷灰石成分出现,提示有新骨形成,16周时羟基磷灰石成分明显增多。结论纳米磷酸钙/氧化锆骨组织工程支架材料具有较好的降解性和生物相容性,具有诱导成骨作用,可作为骨组织工程的支架材料。     

负压与BMSCs膜片促进细胞定植和体内成骨的探讨

目的:研究经过负压处理的TCP支架材料与细胞复合后的体内成骨能力。方法:将TCP支架材料负压处理,和骨髓基质细胞(BMSCs)细胞共培养一段时间后,成骨诱导2周,电镜下观察支架材料和细胞复合情况。再将该复合物与BMSCS细胞膜片复合,植入到裸鼠皮下,8周后作组织切片,HE染色和Masson染色,观察其体内成骨能力。结果:负压(有细胞)+膜片组异位移植8周后,内部可见大量胶原纤维和成骨纤维,在团块样组织内部可见大量成骨细胞,并有血管形成。对照组仅有个别细胞密集区,胶原纤维和成骨纤维较少。空白组未见类似情况。结论:经过负压+骨髓基质细胞膜片处理的TCP支架材料,在体内有成骨潜能。     

脂肪来源干细胞在脂肪组织工程中的应用★

学术背景：移植的脂肪颗粒坏死后往往引起纤维囊性化和假性囊肿，此外在治疗中还存在液化、感染等并发症，阻碍了脂肪组织作为软组织填充物在临床上的应用。近年来利用干细胞体内诱导成脂肪组织备受关注，此项技术若能成功应用于临床将会解决传统移植成熟脂肪细胞的各种并发症。 目的：深入认识脂肪干细胞在脂肪组织工程中的应用进展。 检索策略：由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1998-02/2007-02的相关文献，检索词“mesenchymal stem cell，adipose tissue-derived stem cell/adipose tissue-derived stromal cell，tissue engineering，review”，并限定文章语言种类为English。共检索到180篇文献，对资料进行初审，纳入标准：①文章所述内容应与脂肪干细胞及其在脂肪组织工程中的应用密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。排除标准：①重复性研究。②Meta分析。 文献评价：文献的来源主要是通过对脂肪干细胞在脂肪组织工程中的应用方面内容进行汇总分析。所选用的30篇文献中，6篇为综述，其余均为临床或基础实验研究。 资料综合：①脂肪干细胞在形态上与间充质干细胞相似，表达CD44证明其来源于干细胞，可在无血清条件下进行体外培养。在表型上，表达CD29，CD44，CD49，CD71，CD90，CD105，SH2，SH3，不表达CD31，CD34，CD45，CD106。②脂肪干细胞向脂肪分化经历以下过程：多能干细胞→脂肪母细胞→前脂肪细胞→不成熟脂肪细胞→成熟脂肪细胞。过氧化物酶增殖物活化受体和C/EBP家族是控制脂肪细胞分化的中心环节，二者共同协调作用导致脂肪酸连接蛋白、磷酸烯醇式丙酮酸激酶、葡萄糖转运体4和胰岛素受体等基因的表达，这些基因的表达正是脂肪细胞成熟的标志。③种子细胞最终移入体内还需要合适的载体，这种载体必须具有生物相容性，并可生物降解，易于生长因子等促细胞分化和组织形成的分子物质连接和输送，易于生产和使用。组织工程化脂肪应用于治疗主要有二种方案，即体外将种子细胞接种于支架上进行脂肪细胞培养，然后用于移植；另一种将种子细胞与可降解生物材料复合物直接移植到体内进行体内诱导目标组织形成。目前关于生物载体的研究相对较少，在构建工程化脂肪组织过程中，透明质酸及藻酸盐凝胶可作为生物活性基质，但尚有许多问题亟待解决，如对组织特异性生物活性材料的开发。 结论：随着分子生物学和细胞生物学的迅速发展，脂肪干细胞将成为现代组织工程学研究的理想种子细胞，从而代替骨组织来源的间充质干细胞，最终用于以细胞为基础的临床治疗提供前提和保障。     

氟橡胶246B作为胆管替代物的可行性

目的：氟橡胶246B具有比聚乙烯、聚丙烯更好的组织相容性，类似于较为广泛的膨体聚四氟乙烯，而又具有比膨体聚四氟乙烯更好的硬度，自身不易发生形变。通过对氟橡胶246B进行新鲜胆汁浸泡、常规方式消毒和大鼠体内植入实验，明确氟橡胶246B作为人体内植入物、人工胆管替代物的可行性。 方法：实验于2006-06/2007-03在吉林大学超分子结构与材料教育部重点实验室完成。①制作50 mm×10 mm×0.5 mm矩形氟橡胶246B薄片，放入盛有新鲜胆汁的烧杯内浸泡，并放入37℃恒温箱内保存，浸泡30 d后取出，测量拉伸强度、热分解温度、玻璃化转变温度，与浸泡前测得值进行对比，以明确氟橡胶246B长期处于胆汁环境内是否改变其理化性质。②制作50 mm×10 mm×0.5 mm矩形氟橡胶246B薄片，进行煮沸法、甲醛蒸气熏蒸法和甲醛溶液浸泡法消毒，然后测量拉伸强度、热分解温度、玻璃化转变温度，与消毒前测得值进行对比，以明确氟橡胶246B是否可以进行消毒使用。③将氟橡胶246B、膨体聚四氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯制成大小、厚度相等薄片分别植入大鼠腹腔内，30 d后开腹取薄片周围组织制作病理切片，观察其在大鼠腹腔内与周围组织是否存在变态反应及炎症反应情况。 结果：①氟橡胶246B在新鲜胆汁浸泡30 d后，与浸泡前相比，热分解温度、玻璃化转变温度和拉伸强度均改变微小，差异无显著性意义（P > 0.05）。②氟橡胶246B在胆汁浸泡前后、消毒前后均可较好的对抗机械性应力。③对氟橡胶246B进行煮沸法、甲醛蒸气熏蒸法和甲醛溶液浸泡法消毒处理后，测得热分解温度、玻璃化转变温度和拉伸强度与消毒前相比也无明显改变，差异无显著性意义（P > 0.05）。④氟橡胶246B在大鼠体内植入后未出现明显变态或过敏反应，与周围组织炎症轻微，与膨体聚四氟乙烯相似，差异无显著性意义（P > 0.05）。 结论：氟橡胶246B与胆汁长期接触后的主要理化性质未发生明显改变，能够对抗机械性应力，能够消毒使用，不引起变态或过敏反应。因此，氟橡胶246B可以作为胆管替代物材料。     

生物降解材料聚L乳酸的熔融缩聚合成☆

背景：通过对合成工艺和催化剂的优化和选择，合成较高相对分子质量的聚乳酸生物降解材料。 方法：实验于2003-02/2004-10在哈尔滨工业大学市政环境工程学院绿色化学与技术研究中心完成。以L-乳酸为原料，通过熔融缩聚的一步法合成可生物降解的聚L-乳酸。乳酸首先在无催化剂存在条件下发生自催化缩聚反应，生成较低相对分子质量的预聚物OLLA；然后将催化剂加入到OLLA中继续反应，最后得到较高相对分子质量的聚乳酸。实验考察了预聚条件、催化剂种类和用量、催化剂溶解程度、聚合温度及反应时间对聚乳酸分子量的影响。采用傅立叶变换红外光谱仪和核磁共振氢谱对聚合物结构进行了分析确认，通过凝胶气相色谱测定了聚合物的相对分子质量分布。 结果：L-乳酸在140 ℃下，先在30 kPa下脱水反应2 h；然后减压至5 kPa继续反应4 h，可得到黏均相对分子质量(Mη)为6 500左右的OLLA。以SnCl2-TSA复合体系为催化剂，按SnCl2与OLLA质量比= 0.4%，TSA:SnCl2=1.0(mol/mol)的用量和配比，将催化剂加入OLLA中并充分溶解后，在165 ℃左右，5 kPa下搅拌反应8 h左右，至反应物出现爬杆现象时终止反应，可得到Mη约为65 000的聚L-乳酸。 结论：在优化的工艺条件和催化剂下，能够在较短时间（8 h）内获得较高相对分子质量的聚L-乳酸，使该生物降解材料具备了一定的实用价值。     

应用生物信息学网络资源分析预测融合蛋白的二级结构及其理化性质*

目的：利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质，探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达。 方法：①将单链抗体基因（ScFv）与白细胞介素2基因亚克隆至反转录病毒表达载体PLxSN，重组质粒pL(ScFv-IL-2)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞，G418筛选，直至出现抗性克隆，扩大培养，用NIH3T3测定病毒滴度，将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/ScFv-IL-2。②以PCR，RT-PCR以及Western blotting 对ScFv-IL-2基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定。在构建融合蛋白之后，运用DNA分析软件（DNAssist）和蛋白质分析软件（ANTHEPROT V5）分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质。 结果：①经酶切及PCR分析鉴定，成功地构建了融合基因表达载体pL(ScFv- IL-2)SN，并获得高滴度产毒细胞株C26；Western blotting分析证明ScFv- IL-2基因融合蛋白的表达。②运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFv-IL-2DNA序列翻译并获得了氨基酸序列，运用蛋白质分析软件（ANTHEPROT V5）分析融合蛋白的二级结构及其理化性质。 结论：利用生物信息学网络资源可以分析预测融合蛋白的性质，为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据。     

血管内皮生长因子在原核细胞中的活性检测

背景：目前血管内皮细胞生长因子制备困难，来源有限，限制了临床的应用。 目的：用基因工程的方法在大肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子165, 分离纯化并检测其免疫学以及生物学活性。为后期构建携带血管内皮生长因子165蛋白的预成血管化组织工程骨提供了充足的蛋白来源。 设计、时间及地点：开放性实验，单一样本观察，于2005-04/2007-01 在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成。 材料：携带目的基因血管内皮生长因子165的克隆质粒PUC18-VEGF165由西安交通大学第二医院时志斌博士构建, PGEM-T easy质粒购自美国Promerga公司，原核表达质粒购自德国Qiagen公司，DH5α、M15、JM109菌株由陕西省疾病预防控制中心病毒研究室保存。 方法：利用聚合酶链反应亚克隆的方法获得目的基因片段，构建表达质粒pQE30-VEGF165，在大肠杆菌JM109中用IPTG进行诱导表达并使用Ni2+-NTA进行蛋白纯化。经过纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白。 主要观察指标：①人血管内皮生长因子165基因的亚克隆结果。②重组表达载体pQE30-hVEGF165的鉴定结果。③人血管内皮生长因子165蛋白的诱导表达、纯化。④使用ELISA和Western blot技术检测人血管内皮生长因子165蛋白免疫学活性。⑤鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验检测其生物学活性。 结果：重组表达质粒pQE30- VEGF165在大肠杆菌中成功地表达了相对分子质量为23 000的蛋白，其以不溶性的包涵体形式存在，占菌体蛋白的30%左右，经过分离和Ni柱纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白，浓度约为0.2 g/L, ELISA和Western blot实验显示其具有良好的免疫学活性，鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验显示表达蛋白具有良好的生物学活性。 结论：实验在原核细胞中稳定、高效表达了具有活性的血管内皮生长因子165蛋白，为后期预构血管化组织工程骨的构建提供了充足的蛋白来源。     

微载体培养技术的研究与进展

背景：微载体培养技术是一种新兴的大规模细胞培养技术,广泛地应用于组织工程中种子细胞的扩增。微载体具有比表面积大等优点,在微载体培养技术中具有决定性作用。 目的：文章就近年来制备微载体的生物材料和方法的研究进展做一综述,为微载体培养技术和组织工程的研究提供理论基础。 方法：由第一作者于2009-10应用计算机检索PubMed数据库、万方数据库和维普数据库相关文献。英文资料的检索时间为1967/2009;中文资料的检索时间为1990/2009。英文检索词为“microcarrier,biomaterials cell culture, tissue engineering”;中文检索词为“微载体,生物材料,细胞培养,组织工程”。 纳入标准：①微载体材料、制备工艺及性能的研究。②微载体细胞培养的研究。③动物实验及临床应用。阅读标题和摘要进行筛选,共纳入34篇用于综述。 结果与结论：虽然国内外研究人员在微载体的研究与制备方面做了很多工作,但迄今仍与临床应用有一定的距离。目前的主要工作是将不同种类的材料通过新型的工艺制备得到复合材料,通过表面改性来调节微载体的力学和生物降解性能。 关键词：微载体;生物材料;细胞培养;制备工艺;组织工程;综述文献 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.16.024     

重组人骨形态发生蛋白2在下颌骨牵引成骨过程中的作用

背景：重组人骨形态发生蛋白2能诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化形成软骨和骨,从而导致新骨的形成。 目的：观察在下颌骨牵引成骨过程中应用基因重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)对成骨的影响。 方法：选用日本成年大耳白兔45只,随机分为3组,建立下颌骨牵引模型,分别将空白胶原、1.5 mg和3.0 mg重组人骨形态发生蛋白2胶原复合物植入下颌骨切开处,固定、牵引0.4 mm/次,2次/d,共计5 d,总延长下颌骨4 mm。在稳定期第1,3,7,14,28天分别处死各组动物,取牵引区新生骨痂行放射学及组织学检测。 结果与结论：重组人骨形态发生蛋白2组中的新生骨组织较空白胶原对照组中多且成熟,3.0 mg重组人骨形态发生蛋白2组较1.5 mg重组人骨形态发生蛋白2组新骨形成多且成熟。结果表明,重组人骨形态发生蛋白2能促进兔下颌骨牵引成骨,并且具有浓度依赖性。