P2X7受体对牙周膜干细胞成骨分化的作用

背景:研究影响牙周膜干细胞成骨分化的相关离子通道。目的:初步观察P2X7受体在人牙周膜干细胞成骨分化中的作用。方法:分离培养人牙周膜干细胞,分为4组,分别添加成骨诱导液和100 nmol/L三磷酸腺苷、成骨诱导液、100 nmol/L三磷酸腺苷及普通培养基培养,于成骨诱导7,14 d,利用茜素红染色检测成骨效果,q RT-PCR,Western blot检测OCN、Runx2以及P2X7受体的表达。结果与结论:茜素红染色显示成骨诱导液+三磷酸腺苷组牙周膜干细胞的成骨效果在7 d时显著好于成骨诱导液组,但在14 d时成骨诱导液组成骨效果显著好于成骨诱导液+三磷酸腺苷组(P<0.05);在成骨诱导7 d时,qR T-PCR结果显示成骨诱导液+三磷酸腺苷组Runx2,OCN mR NA的表达达到峰值,而14 d时明显降低(P<0.05)。成骨诱导7 d时,成骨诱导液+三磷酸腺苷组P2X7受体mR NA的表达量明显高于三磷酸腺苷组(P<0.05),成骨诱导液组和对照组未见P2X7受体mR NA的表达,成骨诱导14 d时,成骨诱导液+三磷酸腺苷组表达量下降,明显低于三磷酸腺苷组,差异有显著性意义(P<0.05)。Western blot结果显示,成骨诱导7 d时,成骨诱导液+三磷酸腺苷组P2X7受体的表达达到峰值,高于三磷酸腺苷组,而成骨诱导液组表达量低,对照组几乎没有表达;成骨诱导14 d时,成骨诱导液+三磷酸腺苷组P2X7受体的表达比7 d时明显下降,而三磷酸腺苷组P2X7受体的表达比7 d时有所增加。结果表明外源性三磷酸腺苷可在牙周膜干细胞成骨诱导前7 d明显提高成骨效果,但在7 d后,抑制成骨诱导效果,三磷酸腺苷可以激活牙周膜干细胞P2X7受体表达,且P2X7受体的表达与牙周膜干细胞的成骨效果正相关。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间充质干细胞体内分化的影响

背景：体外研究显示,碱性成纤维细胞生长因子能促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。然而,在体内环境下经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子能否促进骨髓间充质干细胞分化尚不明确。目的：探讨经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间充质干细胞在体内分化的影响。方法：①杂种犬12只,采用密度梯度离心与贴壁培养法在体外分离、培养骨髓间充质干细胞,增强型绿色荧光蛋白慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞并分析转染率。②开胸结扎法建立急性心肌梗死模型,1周后将存活犬（n=10）随机分为骨髓间充质干细胞组（n=5）和碱性成纤维细胞生长因子＋骨髓间充质干细胞组（n=5）,采用OTW球囊经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子和增强型绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞。移植后1周,免疫荧光法比较两组梗死心肌内增强型绿色荧光蛋白阳性细胞共表达Ⅷ因子和肌钙蛋白I的数量。结果与结论：增强型绿色荧光蛋白慢病毒成功转染骨髓间充质干细胞,转染率达85%;灌注后免疫荧光显示,23.5%的切片可以看到增强型绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞阳性细胞;碱性成纤维细胞生长因子＋骨髓间充质干细胞组增强型绿色荧光蛋白共表达Ⅷ因子和肌钙蛋白 I 的细胞数量明显高于骨髓间充质干细胞组（P＆lt;0.05）。因此,经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子能更有效地促进骨髓间充质干细胞分化成血管内皮细胞和心肌细胞;采用该途径联合灌注碱性成纤维细胞生长因子和骨髓间充质干细胞有望发挥协同作用,更好地促进心脏修复。     

兔骨髓间充质干细胞向尿路上皮分化后构建膀胱组织工程化移植物

背景：尿路上皮细胞是泌尿系组织工程领域重要的种子细胞,但是难以体外大量扩增;有研究表明骨髓间充质干细胞可以向尿路上皮细胞分化,但关于分化后细胞在植入动物体内后上皮生成情况,以及分化后细胞在组织工程领域的具体应用研究尚不多。目的：分离、扩增兔骨髓间充质干细胞,诱导骨髓间充质干细胞向尿路上皮细胞分化并与兔膀胱脱细胞基质构建组织工程化移植物,了解分化后细胞作为种子细胞的效果。方法：12只8周龄雄性新西兰大白兔胫骨穿刺,抽取骨髓,密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,第4或5代细胞以条件培养基培养2周,进行分化后细胞的鉴定。随后将分化后细胞种植在膀胱脱细胞基质上构建组织工程化移植物,进行膀胱修补;另12只动物作为对照组以尿路上皮细胞与膀胱脱细胞基质构建复合物行膀胱修补。结果与结论：骨髓间充质干细胞培养成功并在体外扩增,由条件培养基培养诱导分化后,PCR检测提示分化后细胞干细胞标志物CD44表达降低,而上皮细胞标志物UP1a表达升高,行免疫荧光检测发现分化后细胞能表达尿路上皮特异性标志物UP1a,而骨髓间充质干细胞无表达。分化后细胞构建的组织工程化移植物在膀胱修补2周后可形成稳定连续的上皮覆盖,上皮层厚度与尿路上皮细胞构建的组织工程化移植物类似。提示骨髓间充质干细胞向尿路上皮诱导分化后可作为泌尿系组织工程的种子细胞,可能是尿路上皮细胞之外的又一新选择。     

胎盘来源间充质干细胞的体外诱导成软骨分化

背景：胎盘间充质干细胞已被证实有较强的增殖能力,且能向成骨细胞、成神经细胞、类肝样细胞等诱导分化,但对其成软骨细胞诱导分化的研究不多。目的：在体外诱导人胎盘间充质干细胞成软骨细胞分化。方法：体外培养人胎盘间充质干细胞并鉴定。取第3代胎盘间充质干细胞,调整细胞悬液浓度为1.6×1010 L-1,在24孔板中央分别滴5,10,15μL细胞悬液,培养2 h（目的是形成微团）;然后加入间充质干细胞培养基或软骨诱导培养基培养14 d,阿利新蓝染色,进行大体观察及倒置显微镜观察。结果与结论：应用间充质干细胞培养基培养的对照组,细胞增殖形成大量贴壁细胞,贴壁细胞具有典型的间充质细胞形态;应用软骨诱导培养基培养后,细胞只保持微团,不继续增殖形成贴壁细胞,微团基部无贴壁细胞,随着接种细胞数量的增加,微团直径增大。说明人胎盘来源间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力,可作为组织工程、细胞治疗等应用的种子细胞来源。     

脐血源干细胞的特性及临床应用

一、脐血干细胞的概念及其主要成分的生物学和免疫学特征 （一）脐血干细胞的概念及其主要成分 脐血是指足月胎儿娩出后,经结扎脐带后引流收集到的残存在胎盘和脐带中的血液。脐血干细胞是脐带血中富含的一类具有自我更新和多向分化潜能的原始祖细胞。在一定条件诱导下可分化为所需的目的细胞或组织。目前发现脐血干细胞中主要是脐血源造血干细胞（CB-HSCs）和脐血源间充质干细胞（CB．MSCs）,另外还有极少量的脐血源无限制成体细胞（USSC）、脐血源内皮祖细胞（CB-EPCs）等具有增殖分化能力的早期干／祖细胞。     

骨髓间充质干细胞防护肾脏衰老的作用及其机制

背景：骨髓间充质干细胞具有分化成肾小管上皮细胞的功能,故推测,间充质干细胞可能具有治疗慢性肾功能减退的作用。 目的：研究骨髓来源的大鼠间充质干细胞防护肾脏衰老的作用及其可能的机制。 方法：实验建立衰老大鼠模型,尾静脉移植骨髓来源的大鼠间充质干细胞,应用荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂标记体外培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞,将其回输肾脏衰老大鼠体内,应用荧光显微镜下观察间充质干细胞是否能够归巢于肾脏;全自动生化仪测定各组大鼠血清中尿素氮及肌酐水平变化;采用免疫荧光法,利用计算机图像叠加技术,观察蓝色荧光4’,6-二脒基-2-苯基吲哚分别与红色荧光的肾小管上皮细胞特异性蛋白-角蛋白的叠加情况。 结果与结论：骨髓来源的大鼠间充质干细胞能够归巢到衰老大鼠的肾脏。与衰老大鼠模型组相比,经过间充质干细胞生物治疗后的衰老大鼠血清中尿素氮及肌酐水平显著降低（P 〈0.05）,肾脏组织可见少量4’,6-二脒基-2-苯基吲哚及异硫氰酸荧光素标记的角蛋白双染阳性细胞。结果显示,骨髓来源的大鼠间充质干细胞通过向肾小管上皮分化,这可能是其改善衰老大鼠肾脏的机制之一。     

诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立

背景：目前,大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立,但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。 目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。 方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞,获得了诱导多能性干细胞;在诱导分化体系中添加了 Y-27632,克服干细胞扩增中的凋亡现象;运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。 结果与结论：①前3代细胞克隆传代时,诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多,很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断 ROCK活化的抑制剂,能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在 OP9细胞条件培养液作用下,经过体外诱导分化,形成CD34＋造血祖细胞。     

人血小板裂解液替代胎牛血清大规模扩增人脐带间充质干细胞

背景：目前国内外大多数实验仍采用经典的培养基和胎牛血清进行脐带间充质干细胞培养,血清培养潜在的不安全因素限制了未来临床应用的可行性。目的：以人血小板裂解液替代胎牛血清培养、鉴定人间充质干细胞,以期进一步应用于临床低密度扩增人间充质干细胞。方法：人血小板裂解液通过反复冻融、离心、过滤、浓缩等方法制备。以 IMDM 为基础培养基,添加5%浓缩血小板裂解液作为实验组培养基;以添加体积分数10%胎牛血清为对照组培养基。采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,以3000/cm2的浓度进行传代培养,待细胞扩增至P5代后,进行细胞形态与直径、免疫表型、成骨成脂分化、克隆形成率等细胞生物学特性检测,并比较两者之间的差别。结果与结论：人血小板裂解液扩增的脐带间充质干细胞形态细长,有更高的细胞累积群倍数;克隆形成检测结果显示两者形成的克隆效率差异无显著性意义,流式细胞术检测结果显示两者有相似的细胞表型,体外诱导分化显示两者都具有成骨、成脂分化能力,但人血小板裂解液扩增的间充质干细胞成骨分化能力更强。提示人血小板裂解液可以取代胎牛血清用于临床低密度扩增人间充质干细胞。     

人骨髓间充质干细胞移植促进脑梗死大鼠神经细胞再生和神经功能恢复

背景：有研究表明,骨髓间充质干细胞或神经干细胞同种移植可改善脑梗死模型鼠神经功能。目的：观察人骨髓间充质干细胞在移植大鼠脑神经功能梗死局部的内存活、迁移情况及神经细胞再生。方法：将人骨髓间充质干细胞经静脉注入免疫抑制的大脑中动脉闭塞模型大鼠,每周观察、记录移植大鼠的行为和神经功能状况（NSS评分、转棒实验）;于移植后1~8周处死大鼠,采用免疫组织化学染色,免疫荧光染色和RT-PCR检测检测移植大鼠大脑人细胞核抗原、神经干细胞标志物（巢蛋白）及神经细胞标志物（神经元核心抗原、脑型微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白）的表达。结果与结论：骨髓间充质干细胞移植后2周,脑梗死模型鼠NSS评分明显降低（P〈0.05）、转棒实验停留时间明显延长（P〈0.01）,神经功能得到改善（P〈0.05）。人骨髓间充质干细胞移植后1~8周,在移植大鼠病变侧室管膜下区、海马齿状回、梗死灶周围均可检测到人细胞核抗原阳性细胞。移植后一二周,在移植大鼠病变侧室管膜下区、海马齿状回（CA1,CA3区）、梗死灶周围可见部分巢蛋白阳性细胞和mRNA表达,存续至8周。移植后2周,在移植大鼠病变侧室管膜下区、海马齿状回、梗死灶周围可见部分神经元核心抗原、脑型微管蛋白阳性细胞和mRNA的表达。移植后4~8周,在海马、梗死灶周围可见少量胶质纤维酸性蛋白阳性细胞和少量mRNA的表达。结果证实,静脉移植人骨髓间充质干细胞能在脑梗死模型大鼠脑内存活、并迁移至病变部位,继而分化为神经细胞,促进新生神经细胞的形成,改善移植大鼠的神经功能。