转基因番茄中外源目的基因检测方法的筛选

目的用普通PCR和real-time PCR两种方法检测转基因番茄中的外源基因,通过优化条件建立一种灵敏、准确检测转基因番茄中外源基因的方法。方法以防龋用转基因番茄为实验材料,通过SDS和植物基因组DNA提取试剂盒两种方法提取植物总DNA,用普通PCR和real-time PCR检测转基因番茄中的外源目的基因。结果植物基因组DNA提取试剂盒提取样品在琼脂糖凝胶电泳图上出现单一条带,条带清楚无拖尾,而用SDS法检测时常会出现拖尾现象。用普通PCR法重复检测40株转基因番茄平均检出率为88.75%,出现假阴性结果,而用real-timePCR法检测相同样本未出现假阳性或假阴性结果,检出率为100%。结论植物基因组DNA提取试剂盒结合real-time PCR技术是检测转基因番茄中外源目的基因的一种准确、灵敏的方法。     

细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫BALB/c小鼠后脾T淋巴细胞增殖的动态观察

目的动态观察细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫小鼠后脾T淋巴细胞的增殖情况。方法热絮凝法提取转基因苜蓿疫苗叶蛋白,配成浓度为20μg／μL。88只BALB／c小鼠随机分为两组,用100μl（约含1μg融合抗原）口服灌胃和10μl（约含0．1μg融合抗原）鼻腔黏膜接种分别免疫小鼠,每3天1次,连续免疫2月。在末次免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、i8和20周各组随机剖杀4只小鼠,取脾,分离脾细胞．体外经Eg粗抗原（EgAg）或刀豆素A（ConA）刺激培养,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测免疫小鼠脾T淋巴细胞增殖情况。结果口服灌胃组的脾T淋巴细胞增殖水平在末次免疫后4～10周升高,在末次免疫后6周达最高水平;鼻腔黏膜接种组的脾T淋巴细胞增殖水平在末次免疫后4～12周升高,在末次免疫后6周达最高水平;鼻腔黏膜接种组脾T淋巴细胞增殖水平高于口服灌胃组。EgAg或ConA刺激组脾T淋巴细胞增殖水平高于相应原液组,且ConA刺激组高于相应EgAg刺激组（P〈0．01或P〈0．05）。结论细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗能诱导免疫鼠产生脾T淋巴细胞增殖反应,鼻腔黏膜接种途径优于口服灌胃途径。     

三羟异黄酮对孕期乳腺癌(MMTV)-ErbB-2转基因子代小鼠乳腺肿瘤的干预作用

目的观察三羟异黄酮干预孕期乳腺癌（MMTV）-ErbB-2转基因小鼠对其子代小鼠乳腺肿瘤发生、发展的影响。方法按三羟异黄酮20μg、100μg溶于2%二甲基亚砜（DMSO）和0.05mL植物油中,对照组给予等量植物油处理,将孕鼠随机分为低、高剂量三羟异黄酮给药组和正常对照组,每组30只,自孕期第13～19天采用母鼠后腿外侧皮下注射,观察三羟异黄酮给药组子代雌性小鼠和对照组子代雌性小鼠乳腺肿瘤的潜伏期和乳腺成瘤率是否存在差异,并用免疫组织化学染色SP方法检测子代小鼠乳腺肿瘤组织p53的表达情况。结果高剂量组乳腺肿瘤潜伏期、乳腺成瘤率与其他各组相比具有统计学差异（P〈0.05）;高剂量组p53的阳性表达水平明显低于其他各组（P〈0.05）。结论孕期使用高剂量异黄酮可以延长子代雌性小鼠肿瘤发生的潜伏期,降低乳腺成瘤率,并且可以降低子代小鼠乳腺肿瘤中p53的阳性表达水平,提示三羟异黄酮对乳腺癌（MMTV）-ErbB-2转基因小鼠乳腺肿瘤的发生、发展具有一定的预防作用。     

GFP转基因鼠胚胎神经上皮 干细胞的体外培养

目的观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）转基因鼠来源的胚胎神经上皮干细胞体外增殖和分化的情况。方法将来源于孕11dGFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞与普通大鼠神经上皮干细胞进行体外培养,比较二者克隆增殖、分化的状况。结果GFP转基因鼠胚胎神经上皮干细胞可在体外进行克隆增殖,并能分化为神经元和神经胶质细胞,与普通鼠神经上皮干细胞比较没有差异。结论GFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞可在体外克隆及分化,并能稳定地表达绿色荧光蛋白。     

深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的原核表达和转基因植株再生研究

目的通过农杆菌介导法将来源于深黄被孢霉的△^6-脂肪酸脱氢酶（IND）基因导入到东北大豆绥农10和吉林47中,最终获得转基因植株。方法利用子叶节外植体诱导出丛生芽和再生植株,利用卡那霉素的抗性筛选培养基连续筛选以及PCR方法、DNA分子杂交分析和GC分析检测转基因植株中的△^6-脂肪酸脱氢酶基因表达状况。结果经过含50mg／L卡那霉素的抗性筛选培养基连续筛选,获得了一批转基因植株。经PCR检测和DNA分子杂交分析,初步证明△^6-脂肪酸脱氢酶基因已导入并整合到大豆基因组中。将转基因大豆T1代和T2代种子进行脂肪酸GC分析,结果在大豆种子中检测到△^6-脂肪酸脱氢酶基因的产物GLA,证明该基因在大豆中得到了表达。     

HRX-EEN融合基因转基因小鼠行为能力的异常

目的 观察HRX-EEN融合基因转基因小鼠行为能力的异常.方法 应用Morris水迷宫实验测试并比较HRX-EEN融合基因转基因小鼠(转基因组,n=12)和C57/BL小鼠(对照组,n=12)的学习和记忆能力,包括前4天的隐蔽平台实验和第5天的空间探索实验.结果 隐蔽平台实验中,转基因组小鼠的逃避潜伏期长于对照组,除第1天外,其余各天差异均具有统计学意义(P<0.05);空间探索实验中,转基因组小鼠目标象限内搜索时间、经过目标平台位置次数和在中心区域时间显著少于对照组(P<0.01).结论 HRX-EEN融合基因转基因小鼠的学习和记忆能力显著下降.     

一种红色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立广泛表达红色荧光蛋白(RFP)的转基因小鼠,便于组织和细胞移植研究.方法:把DsRed基因片段插入到pCAGGS载体的强启动子下游构建转基因载体pCAG-DsRed.经细胞转染验证,受精卵原核注射,建立红色荧光蛋白转基因C57BL/6小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型;红色荧光蛋白在组织中的表达情况,则通过荧光显微镜检测小鼠各组织器官冰冻切片.结果:pCAG-DsRed载体可以在真核细胞中表达RFP,经基因型分析和表型观察,得到两只红色荧光蛋白的首建鼠.经荧光显微镜观察各组织冰冻切片发现红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,其中在神经系统和肌肉组织中表达量较高.结论:成功建立了一种红色荧光蛋白转基因小鼠,红色荧光蛋白在转基因小鼠的神经系统和肌肉组织等中高表达.     

不同月龄阿尔茨海默病模型小鼠行为学改变与胆碱酯酶活性的关系

目的：研究不同月龄淀粉样前体蛋白（APP）转基因小鼠学习记忆功能,脑皮质,海马胆碱酯酶以及突触蛋白-Ⅰ的变化.方法：采用Morris水迷宫测试学习、记忆功能,比色法测定胆碱酯酶活性,免疫组织化学法测定突触蛋白-Ⅰ变化.结果：6,9,12mo APP阳性转基因小鼠（APP^＋）学习、记忆能力明显降低,9～12月龄降低尤为显著;皮层,海马胆碱酯酶活性降低,且皮层胆碱酯酶活性下降更为明显;海马CAⅠ区突触蛋白-Ⅰ的表达随着月龄的增加而减少.结论：APP转基因小鼠学习、记忆功能与海马内胆碱酯酶活性及突触蛋白-Ⅰ的表达呈负相关.说明在阿尔茨海默病（AD）的发病机制中乙酰胆碱的变化和神经突触的萎缩都是重要原因.     

TGF-β与乳腺癌的关系

正1TGF-β的结构和功能1.1转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)是一种可以调节细胞生长,分化和促进细胞外基质形成的多功能多肽,其广泛存在于多种细胞组织中。对转基因动物模型的研究表明,TGF-β介导的信号转导通路在正常乳腺组织和乳腺肿瘤的发生发展过程中起到极其关键的作用。在对于乳腺癌发病机制的研究中,TGF-β表现出具有抑制早期癌变的作用,但是随着肿瘤的发展,这种抑制作用常被逆转进而促进肿瘤的发展,考虑和TGF-β的多效性和对环境的高度依赖性有关TGF-β治疗性调节可能也是众多因素之一。     

一种改进的显微注射用DNA片段的纯化方法

目的显微注射用DNA的纯度是影响转基因动物制备成功与否的重要因素,本文建立一种可行的适用于普通实验室的纯化DNA方法,替代普遍使用的试剂盒纯化方法。方法分别使用酚-氯仿多次抽提法及常规的凝胶提取试剂盒纯化含有蚓激酶基因的DNA片段,通过显微注射技术将纯化的DNA片段导入小鼠受精卵的原核,制备转基因小鼠。根据转基因实验的结果对两种方法进行比较。结果使用两种方法纯化DNA均能获得转基因小鼠。在DNA纯度及注射卵的存活率上,两种方法无明显差别;在移植卵的出生率及转基因阳性率上,抽提法优于试剂盒法。结论本实验建立的抽提方法可以替代试剂盒方法纯化显微注射用DNA片段,在降低实验成本、简化实验条件及提高转基因阳性率方面具有优势。