Effects of eukaryotic expression plasmid encoding human tumstatin gene on endothelial cells in vitro

摘要： 背景 肿瘤抑素（tumstatin）是一种新型的内源性血管生成抑制剂,目前的研究大都是用纯化的肿瘤抑素蛋白。本研究的目的是研究肿瘤抑素过表达质粒的体外抗血管生成作用,揭露其抑制血管内皮细胞生长的潜在机制,并寻找一种能够持续释放肿瘤抑素的方法。 方法：构建了肿瘤抑素真核表达质粒pcDNA-tumstatin并用它转染人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞和人肾癌细胞系ACHN细胞。采用RT-PCR和Western blot技术分别检测tumstatin在两种细胞中的表达情况。通过细胞增殖实验（CCK-8）和细胞周期分析评价tumstatin 过表达对ECV304细胞增殖的影响。为研究pcDNA-tumstatin 体外抑制血管内皮细胞的机制,采用western blot技术检测细胞周期蛋白D1的蛋白水平。 结果 DNA测序确认了pcDNA-tumstatin质粒构建成功。RT-PCR和western blot 结果表明tumstatin能在这两种细胞中有效表达。Tumstatin基因转入后,ECV304细胞生长受到明显抑制,细胞周期停滞于G1期。我们的研究也表明,pcDNA-tumstatin可能通过下调cyclin D1蛋白的水平来抑制血管内皮细胞增殖。 结论 pcDNA3.1+介导的tumstatin过表达能够特异性的抑制血管内皮细胞的增殖,这可能是由于cyclin D1下调导致的细胞周期阻滞于G1期导致的。此外,基因治疗或许是持续释放tumstatin的一种新的策略。     

Function of endogenous inhibitors of angiogenesis as endothelium-specific tumor suppressors

Disruption of the systemic angiogenesis balance to favor enhanced angiogenesis is speculated to represent a key step in the growth of tumors. Although a major emphasis has been placed on the increase of angiogenesis stimulators, such as VEGF, on the disruption of the angiogenic balance, the potential role of the physiological levels of endogenous inhibitors of angiogenesis on tumor growth is poorly understood. Here, we use three independent lines of mice deficient in tumstatin, endostatin, or thrombospondin-1 (TSP-1), to address the role that these endogenous angiogenesis inhibitors play in tumor growth. Our experiments demonstrate that normal physiological levels of these inhibitors serve to retard the growth of tumors, and that their absence leads to enhanced angiogenesis and a 2- to 3-fold increase in tumor growth. The tumor-suppressive action of TSP-1, endostatin, and tumstatin correlates with expression of CD36 receptor, alpha5beta1 integrin, and alphavbeta3 integrin on proliferating endothelial cells, respectively. Moreover, tumors grow 2-fold faster in the tumstatin/TSP-1 double-knockout mice, compared with either the tumstatin- or the TSP-1-deficient mice, strongly suggesting that ceiling rate of cancer growth is not completely dependent on the genetic defects of cancer cells but also depends on the host-derived tumor microenvironment. Additionally, tumor growth in transgenic mice overproducing endostatin specifically in the endothelial cells (a 1.6-fold increase in the circulating levels; mimicking Down's syndrome condition) is 3-fold slower than the tumor growth in wild-type mice. Collectively, our data suggest that physiological levels of endogenous inhibitors of angiogenesis can serve as endothelium-specific tumor suppressors.     

Tumstatin transfected into human glioma cell line U251 represses tumor growth by inhibiting angiogenesis

Background Angiogenesis is a prerequisite for tumor growth and plays an important role in rapidly growing tumors,such as malignant gliomas.A variety of factors controlling the angiogenic balance have b...     

肿瘤抑素抗血管活性相关肽的表达及活性研究

目的利用大肠杆菌表达系统表达肿瘤抑素抗血管活性相关肽-21肽,检测其生物学活性。方法人工合成21肽基因序列(肿瘤抑素75～95位氨基酸),克隆到表达载体pTYB2上,转化大肠杆菌BL-21(DE_3),酶切和测序鉴定后,用IPTG诱导表达融合蛋白。经几丁质亲和层析柱纯化21肽。通过MTT实验,细胞生长曲线测定,小鼠肝癌转移瘤模型的大体抑瘤实验及组织病理学切片研究其活性。结果获得的可溶性21肽对人脐静脉内皮细胞的生长具有抑制作用。小鼠肝癌转移瘤模型的大体抑瘤实验抑瘤率达42.86%。组织病理学切片结果可见H22小鼠肝癌细胞死亡,血管数量减少。结论经初步检测获得具有抗血管活性的21肽,为进一步研究肿瘤抑素的作用机制和肿瘤的临床治疗奠定了基础。     

Oncol2012: 转染肿瘤抑素（Tumstatin)的U251胶质瘤细胞通过抑制血管生成遏制肿瘤生长的体内外实验研究

背景 血管生成是肿瘤生长的必要条件,尤其在快速生长的肿瘤（如恶性脑胶质瘤）。既往研究表明有很多促血管生成因子和抑制血管生成因子共同控制血管生成的平衡“开关”。其中,内源性血管生成抑制因子,如肿瘤抑素（Tumstatin)近年越来越受到重视。本研究探索脑胶质瘤细胞表达Tumstatin能否抑制血管生成,进而抑制肿瘤生长。方法 我们用脂质体转染法将Tumstatin转染入恶性胶质瘤细胞系U251,并用G418筛选出稳定转染的U251细胞系,并用western blot证实转染成功。在体外用稳定转染的U251细胞上清培养内皮细胞（HUVECs),用MTT法、小管形成实验、流式及动物实验检测Tumstain的生物功能。结果 Tumstatin转染组、空质粒转染组、未转染组U251细胞增殖活性无显著差别;Tumstatin在体外能显著抑制HUVECs的增殖,诱导其凋亡、抑制其形成小管的能力。裸鼠皮下成瘤实验结果显示转染组能明显抑制肿瘤生长,免疫组化结果显示微血管密度明显比空质粒组及未转染组低,但三组见ki67增殖指数无统计学差异。结论 人Tumstatin有抑制U251移植瘤生长的作用,通过抑制肿瘤血管生成可能是其主要机制。     

Tum-5基因对肝细胞癌生长的抑制作用和对血管生成的影响

目的：探讨肿瘤抑素5（Tum-5）基因对肝细胞癌的抑制作用及对血管生成的影响,阐明其参与抗肿瘤生成的作用机制。方法：体外实验选择人肝癌HepG-2细胞,采用不同感染复数（MOI）（0、1、5、10、25和50）的pLXSN和pLXSN-Tum-5病毒颗粒感染72h,MTT法检测各组细胞增殖率。体内构建肝癌H22荷瘤小鼠模型,分为saline组、pLXSN组和pLXSN-Tum-5组,每组5只。saline组小鼠瘤内注射生理盐水,pLXSN组和pLXSN-Tum-5组小鼠瘤内分别注射相应的病毒颗粒（MOI=5）,隔日注射,共注射5次。测定各组小鼠移植瘤体积、质量和小鼠体质量,免疫组织化学法检测CD31蛋白在各组小鼠移植瘤组织中的表达,计算微血管密度（MVD）。结果：与pLXSN组比较,不同MOI pLXSN-Tum-5组的细胞增殖率差异无统计学意义（P> 0.05）;荷瘤鼠瘤内注射结束后,pLXSN-Tum-5组小鼠移植瘤体积和质量均明显小于pLXSN组和saline组（P< 0.05或P< 0.01）;免疫组织化学检测,各组小鼠移植瘤内均有形态不规则的新生血管生成,与saline组和pLXSN组比较,pLXSN-Tum-5组小鼠移植瘤组织MVD平均值明显降低（P< 0.05）。结论：Tum-5可通过抑制肝癌组织内新生血管的生成发挥抑瘤作用。     

人肿瘤抑素(tumstatin)的基因克隆及其原核表达

目的克隆人肿瘤抑素(tumstatin)基因,并进行其在大肠杆菌表达的研究。方法用RT-PCR技术从人肾癌旁组织中扩增出肿瘤抑素的cDNA,构建原核表达载体pQE-tum,IPTG诱导重组蛋白质的表达,并利用Ni-NTAHis-Bind树脂纯化该重组蛋白质。结果经PCR扩增成功获得742 bp的人肿瘤抑素基因,测序正确。在大肠杆菌中目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的10%,SDS-PAGE及Western blot分析显示,其相对分子质量为28 000,纯化后的6×His-tumstatin纯度可达92%。结论tumstatin基因克隆、表达及纯化的成功,为其今后的肿瘤抗血管生成治疗研究奠定了基础。     

血管基膜衍生多功能肽基因克隆、表达及空间构象分析

目的：构建血管基膜衍生多功能肽克隆和原核表达载体，并对血管基膜衍生多功能肽氨基酸序列进行空间结构分析预测。方法：用人源性IgG3上游铰链区连接肽连接的Tumstatin的2个功能区片段，即血管基膜衍生多功能肽(VBMDMP)，利用合成的3条长引物片段，进行PCR扩增。克隆到pUC19载体，酶切和测序鉴定。亚克隆构建原核表达载体pGEX4T1VBMDMP,IPTG诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物。用Glutathione Sepharose 4B层析柱进行了亲和层析鉴定。将VBMDMP序列输入计算机，利用Antheprot软件分析。结果：血管基膜衍生多功能肽（VBMDMP）基因经限制性内切酶酶切和测序鉴定，其大小和核苷酸序列正确，与设计完全一致。获得了原核表达融合蛋白GSTVBMDMP。Antheprot分析显示，人IgG3上游铰链区连接后的Tumstatin的2个功能区域能自由伸展。结论:成功构建了血管基膜衍生多功能肽克隆和原核表达载体，并对其进行了空间结构分析