Mast cell corticotropin-releasing factor subtype 2 suppresses mast cell degranulation and limits the severity of anaphylaxis and stress-induced intestinal permeability

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Pulmonary delivery of siRNA against acute lung injury/acute respiratory distress syndrome

The use of small interfering RNAs (siRNAs) has been under investigation for the treatment of several unmet medical needs, including acute lung injury/acute respiratory distress syndrome (ALI/ARDS) wherein siRNA may be implemented to modify the expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines at the mRNA level. The properties such as clear anatomy, accessibility, and relatively low enzyme activity make the lung a good target for local siRNA therapy. However, the translation of siRNA is restricted by the inefficient delivery of siRNA therapeutics to the target cells due to the properties of naked siRNA. Thus, this review will focus on the various delivery systems that can be used and the different barriers that need to be surmounted for the development of stable inhalable siRNA formulations for human use before siRNA therapeutics for ALI/ARDS become available in the clinic.     

抑制血管内皮生长因子表达的pSUPER-H1 RNA干扰系统的构建

目的构建抑制血管内皮生长因子（VEGF）活性的小干扰RNA表达载体。方法构建含有PolⅢH1启动子的pSUPER-H1质粒,化学合成3对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,各64个碱基,退火、克隆到经BglⅢ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢH1启动子下游,获得重组pSUPER-H1-VEGF质粒,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,EcoRⅠ、HindⅢ双酶切电泳、测序鉴定。结果重组质粒经EcoRⅢ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析,表明64个碱基的核苷酸序列成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全一致。结论重组pSUPER-H1-VEGF载体成功构建,开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法。     

阻断细胞信号传导子和转录激活子6基因表达对人结肠癌细胞凋亡的影响

目的 探讨细胞信号传导子和转录激活子6（STAT）信号传导通路与结肠癌细胞凋亡的关系。方法构建4个STAT6特异的shRNA质粒载体，应用阳离子脂质体瞬时转染人结肠癌细胞HT-29，以阻断Stat6信号通路；分别用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测STAT6 mRNA表达和运用流式细胞术检测磷酸化STAT6蛋白（pSTAT6）表达来筛选有效的小发夹RNA（shRNA）；运用流式细胞术分析细胞凋亡变化；RT-PCR和Western印迹观察Bcl-2和Bax基因表达。结果成功构建并筛选出两个STAT6特异的shRNA质粒载体；STAT6基因沉默的结肠癌细胞中凋亡细胞明显增加，空白对照组细胞早期凋亡率为0．4％，pshRNA-STAT6-1组和pshRNA-STAT6-4组分别为13．0％和8．8％（P〈0．05）；Stat6信号通路被阻断的结肠癌细胞中Bcl-2基因表达明显减少，而Bax蛋白基因表达明显增多（P〈0．01）。结论Stat6信号传导通路能抑制结肠癌细胞凋亡，可能是通过调节Bcl-2和Bax基因的表达发挥作用。     

靶向整合于MHCC 97-H细胞的HBx基因shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向整合于人肝癌MHCC97-H细胞乙型肝炎病毒x基因(HBxgene)基因的shRNA真核载体。方法依据从人肝癌细胞株MHCC97-H中克隆的HBx基因序列,设计合成X169、X220及MOCK(无关对照)3对寡核酸,经退火成互补双链并克隆至pGenesil-Ⅰ载体;经酶切、PCR和测序鉴定;将鉴定的shRNA质粒脂质体转染MHCC97-H细胞,流式细胞分析转染效率。结果酶切、PCR及测序证实pshRNA-X169/X220/MOCK质粒构建符合设计,转染48h后MHCC97-H细胞可激发绿色荧光,pshRNA-X220转染效率最低。结论成功构建靶向整合于人肝癌细胞HBVx基因特异性shRNA表达载体,并成功转染人肝癌细胞株MHCC97-H细胞,为沉默HBx基因实验性肝癌基因治疗奠定基础。     

S100PshRNA慢病毒载体的构建及其对胃癌MGC-803细胞生物学行为的影响

目的：：构建针对S100P基因的shRNA慢病毒载体,并在胃癌MGC-803细胞上鉴定沉默效率,观察其对细胞生物学行为的影响。方法：筛选的S100P基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA,并与GV115-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,与pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染293T细胞,产生慢病毒。用病毒感染MGC-803细胞,RT-PCR和Western blot检测靶基因的沉默效率、克隆形成情况、细胞周期变化和凋亡实验观察靶基因沉默对MGC-803的影响。结果：构建的重组shRNA慢病毒载体,经293T细胞包装获得病毒颗粒,和阴性对照相比,慢病毒感染组S100 P mRNA表达下降了83.4%,蛋白表达也明显受到抑制。 S100 P沉默后MGC-803的克隆形成能力明显减弱,细胞周期发生S期阻滞,细胞凋亡明显增加。结论：成功地构建了S100P基因shRNA慢病毒表达载体,该载体能够在MGC-803细胞中沉默S100P基因的表达,导致胃癌细胞克隆形成能力降低,细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,表明S100 P基因有可能具有影响胃癌发生发展的作用。     

肿瘤坏死因子α主要通过其受体1作用于鼠肾上腺皮质Y1细胞皮质醇的表达

背景和目的：全身炎症反应综合征时肿瘤坏死因子α（TNF-α）在导致肾上腺相对不足中起着重要的作用。为探讨TNF-α是通过其哪个受体来抑制皮质醇释放,我们研究肾上腺皮质Y1细胞TNF-α受体表达情况及其受体阻断与皮质醇释放间的关系。 方法: 应用RT-PCR和免疫细胞化学方法来评估Y1细胞中的TNF受体的表达。 合成与TNF受体1（TNF-R1）DNA片段相对应的shRNA序列,并克隆于表达载体pcDNA™6.2-GW/EmGFP中,然后转染Y1细胞。采用实时定量PCR（Q-PCR）检测转染shRNA或 mock-shRNA Y1细胞TNF-R1表达的阻断率,同时对转染的Y1细胞加入TNF-α 和 ACTH,检测Y1细胞皮质醇的表达水平。 结果： RT-PCR和免疫细胞化学方法,在肾上腺皮质Y1细胞检测到TNF-R1的表达,而检测不到TNF-R2的表达。shRNA 转染的Y1细胞中TNF-R1 mRNA表达明显低于mock shRNA转染的Y1细胞（P<0.05）。通过shRNA阻断TNF-R1表达,TNF-α就不能抑制ACTH促皮质醇的合成,shRNA 转染Y1细胞的皮质醇表达水平明显高于mock-shRNA Y1细胞(P<0.05)。 结论：我们的结果显示,在肾上腺皮质中,TNF-α抑制ACTH促皮质醇的合成是通过TNF-R1受体。