过表达长链非编码RNA H19促进miR-124-3p表达抑制肝癌细胞增殖

目的 探讨长链非编码RNA H19 (long non-coding RNA H19,IncRNA H19)对miR-124-3p表达的影响及在肝癌细胞增殖中的作用.方法Real-time PCR检测肝癌细胞系及临床标本中lncRNA H19和miR-124-3p的表达;在肝癌细胞系HepG2和SMMC7721中过表达lncRNA H19,Real-time PCR 检测miR-124-3p及其靶基因cyclinD1的表达;Western blot检测cyclinD1蛋白表达水平;CCK-8法检测lncRNA H19对细胞增殖的影响;过表达lncRNA H19同时加入antagomiR-124-3p后,检测miR-124-3p及其靶基因表达情况及细胞增殖情况.结果lncRNA H19和miR-124-3p在肝癌细胞系及肝癌组织中均低表达(P＜0.05);过表达lncRNA H19后miR-124-3p表达显著增加(P＜0.05),miR-124-3p的靶基因cyclinD1蛋白和mRNA表达明显下降(P＜0.05),细胞增殖受到抑制(P＜0.05);过表达lncRNA H19同时干扰miR-124-3p后,细胞增殖抑制作用减弱(P＜0.05).结论长链非编码RNA H19通过促进miR-124-3p表达,进而抑制其靶基因cyclinD1表达而抑制肝癌细胞增殖.     

miRNA-27b对人星状细胞系脂代谢与迁移能力的影响

目的探讨在人肝星状细胞系中miR-27b基因表达异常对LX-2细胞的脂滴沉积与迁移能力的影响。方法转染干预miR-27b的表达,油红染色与划痕实验检测LX-2细胞的脂滴沉积与迁移能力,荧光定量PCR检测靶基因RXRa的表达。结果 miR-27b在人肝星状细胞系LX-2细胞活化过程中表达升高,miR-27b的模拟物可以促进LX-2细胞的迁移、减小胞质内脂滴沉积;相反,miR-27b抑制物可以减弱LX-2细胞的迁移,增加胞质内脂滴沉积。荧光定量PCR结果显示RXRa在转染miR-27b模拟物表达降低,抑制物无明显变化。结论上调miR-27b的表达可能是通过靶基因RXRa促进LX-2细胞的迁移,减少细胞胞质内的脂滴沉积。     

miR-29a促进人乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的机制

探讨微小核酸miRNA-29a对人乳腺癌细胞MCF-7体外迁移和侵袭的促进作用及其机制。采用miR-29a模拟物及miR-29a抑制剂分别上调和下调miR-29a的表达;采用细胞划痕法和Transwell小室法检测miR-29a对细胞迁移和侵袭能力的影响;采用Targetscan7.1数据库预测miR-29a的靶基因;荧光素酶报告法验证miR-29a的靶基因;Western blot和实时荧光定量PCR验证其表达结果。结果表明:miR-29a可显著促进MCF-7细胞的迁移和侵袭能力。Targetscan软件预测HBP1可能为miR-29a的靶基因,荧光素酶报告实验显示miR-29a靶向HBP1基因的3′-UTR区。Western blot和实时荧光定量PCR结果显示,miR-29a下调了HBP1蛋白水平的表达,而mRNA水平则无明显变化。研究结果揭示在乳腺癌中高表达的miR-29a通过下调HBP1,从而使乳腺癌细胞获得高的迁移和侵袭能力,促进乳腺癌的转移。     

小鼠微小RNA miR-22真核表达载体的构建及功能初步研究

目的 从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段并克隆到pIRES2-EGFP,构建miR-22的真核表达载体.方法 利用PCR技术从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段,克隆到质粒pUCm-T,测序正确后构建到真核表达载体pIRES2-EGFP中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行序列测定.脂质体Lipofectamin 2000法转染Hela细胞后G418筛选获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过RT-PCR方法对neo片段进行鉴定,采用Northern blot技术检测miR-22的表达.结果 PCR扩增得到的334 bp片段与预期的miR-22前体对应的基因组片段序列一致;成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/miR-22,测序结果正确.重组质粒转染Hela细胞后,经G418筛选成功获得阳性克隆.Northern blot分析显示miR-22在Hela细胞内高效表达.结论 本实验成功克隆了miR-22的前体对应的基因组片段,构建其真核表达载体,并在Hela细胞内获得高表达,为深入研究微小RNA miR-22的功能奠定了基础.     

miR-145antagomir转染的脂肪间充质干细胞对野百合碱诱导的肺动脉高压的作用

目的：研究miR-145 antagomir转染脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cell,ASC）在野百合碱（monocrotaline,MCT）诱导的大鼠肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）中的作用。方法：建立大鼠PAH模型,随机分为空白对照组（对照组）、MCT造模组（MCT组）、正常ASC注射组（ASC组）、antagomir转染组（antagomir组）和antagomir空载体转染组（antagomirNC组）,分别进行不同处理的ASC移植。2周后测量大鼠右心室压力（right ventricular systolic pressure,RVSP）,取心脏组织和左肺上叶组织进行作病理检查,测量右心室肥厚指数（right ventricle-to-left ventricle+septum,RV/LV+S）、心肌细胞相对横截面积（cross-sectional area,CSA）和肺小动脉内膜+中膜厚度（medial wall thickness+intimal thickness,MT+IT）。结果：病理检查显示antagomir组肺小动脉内膜较MCT组明显变薄。RVSP：ASC组RVSP为22.48±2.67 mmHg,antagomir组为18.77±2.14 mmHg,antagomir NC组为21.92±2.77 mmHg,均低于MCT组的26.85±3.03 mmHg,差异均有统计学意义（P<0.05）,其中antagomir组RVSP降低最明显。RV/LV+S和CSA：ASC组分别为0.33±0.04和349.83±14.21 μm2,antagomir组分别为0.26±0.03和320.67±18.23 μm2（P<0.001）,antagomir-NC组分别为0.3±0.03和356.83±15.36 μm2,均低于NCT组的0.4±0.026和396.33±21.25 μm2,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：miR-145 antagomir转染的ASC可以延缓PAH的进展,为PAH提供了一个潜在的治疗方向。     

miRNA-191对人乳腺癌细胞增殖、侵袭的影响

目的探讨miR-191在人乳腺癌细胞中的表达情况,研究其对乳腺癌细胞的增殖、侵袭的影响。方法 real-time PCR检测乳腺癌细胞[MDA-MB-231(雌激素受体阴性,ER-)、MCF-7(雌激素受体阳性,ER+)]和正常乳腺上皮细胞(HBL-100)中miR-191表达水平的差异;利用Lipofectamine2000将miR-191抑制体瞬时转染乳腺癌MCF-7,并用real-time PCR检测转染效果;分别用CCK-8法检测MCF-7细胞增殖,流式细胞术检测MCF-7细胞的细胞周期,Transwell法检测MCF-7细胞的侵袭能力。结果与正常乳腺细胞相比,miR-191在乳腺癌细胞中高表达(P<0.01),且在ER(+)乳腺癌细胞MCF-7中的表达水平高于ER(-)乳腺癌细胞MDA-MB-231(P<0.01),转染miR-191抑制体后,MCF-7细胞增殖能力(0.65±0.04)较阴性对照组(1.18±0.05)明显受到抑制(F=122.238,P<0.01),侵袭能力(56.67±2.58)较阴性对照组(82.5±5.79)减弱(F=18.734,P<0.01),G0/G1期的细胞比例(73.39±1.10)%较阴性对照组(69.28±2.11)%增加(F=61.060,P<0.01),S期细胞比例(20.9±1.17)%较阴性对照组(25.48±1.19)%减少(F=46.937,P<0.01)。结论 miR-191在人乳腺癌细胞中,特别是ER(+)乳腺癌中高表达,转染miR-191抑制体后,MCF-7细胞增殖、侵袭能力明显受到抑制。     

MicroRNA-10b与早期乳腺浸润性导管癌的临床及预后研究

目的  探讨早期乳腺浸润性导管癌中microRNA-10b（miR-10b）表达与临床指标及预后关系。 方法  采用原位分子杂交技术,检测305例中早期乳腺浸润性导管癌组织miR-10b表达,采用Pearsonχ2检验分析miR-10b表达在不同临床指标间的差异性;采用Spearman秩和相关分析早期乳腺浸润性导管癌中miR-10b、年龄、淋巴结、雌激素受体α（ERα）、孕激素受体（PR）及人类表皮生长因子受体2（HER-2）之间的相关性。采用Kaplan-Meier法计算累计无瘤生存时间,应用Log-rank检验比较miR-10b不同表达组间无瘤生存时间的差异。结果  早期乳腺浸润性导管癌中miR-10b表达与年龄、肿瘤大小和复发转移,差异具有统计学意义（P <0.05）;与月经状态、临床分期、化疗、放疗及内分泌治疗比较,差异无统计学意义（P >0.05）。miR-10b阳性表达与HER-2阳性表达呈正相关,差异有统计学意义（P <0.05）。miR-10b表达阴性中位无瘤生存时间较miR-10b表达阳性时间长,两者比较差异有统计学意义（P <0.05）;淋巴结阴性时miR-10b阴性表达的中位无瘤生存时间较阳性表达长,两者比较差异有统计学意义（P <0.05）;相反,miR-10b表达在淋巴结阳性中位无瘤生存时间无统计学意义（P >0.05）。结论  miR-10b表达水平与早期乳腺浸润性导管癌复发转移相关,特别在无淋巴结转移且miR-10b阳性表达组的中位无瘤生存时间短,预后差。miR-10b阳性表达是早期乳腺浸润性导管癌的预后因素。

     

食管癌组织和癌旁组织miR-9表达差异研究

目的：探讨食管癌癌组织和癌旁组织中miR-9的表达差异,并对潜在的miR-9靶基因进行预测。 方法：采用SYBR Green I染色的实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对50例食管癌及配对癌旁正常组织 标本中miR-9基因的表达水平进行定量分析,并运用生物信息学技术对miR-9的靶基因进行预测。结 果：miR-9在食管癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织（P〈0. 05）,且与患者淋巴结转移有关（P〈0.05）,与性别、年龄、组织学分型、TNM分期无关（P〉0. 05）。对miR-9预测得到GOLPH3、RAB34、 ALCAM靶基因。结论：miR-9在食管癌组织中低表达,而且与淋巴结转移有关,可能在食管癌的发病 中起重要作用。     

miR-192负性调控人肝癌细胞株HepG2中RB1基因的表达

目的 探讨miR-192对人肝癌细胞株HepG2中RB1基因表达的调节作用.方法 运用生物信息学方法对miR-192进行靶基因预测并分析其潜在靶基因RB1;将含有miR-192结合位点的RB1 mRNA 3′端非编码区(3′UTR)片段和在miR-192结合位点进行突变的RB1 3′UTR突变片段克隆至报告基因载体pMIR-Report luciferase vector,重组质粒分别命名为pMIR-RB1和pMIR-RB1-mut;将重组质粒、Beta-gal内参质粒和microRNA共转染HepG2细胞,双荧光素酶报告基因系统检测各实验组中细胞荧光素酶的表达;SYBR Green荧光定量PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测miR-192对内源性RB1表达的调节作用.结果 生物信息学分析筛选出89个miR-192的潜在靶基因,RB1基因是其中之一;测序验证重组质粒pMIR-RB1和pMIR-RB1-mut构建成功;过表达miR-192时,共转染pMIR-RB1质粒的细胞相对荧光素酶活性(4.80±0.36)较相应过表达miR-NC组(7.90±0.91)明显降低(P＜0.05),而共转染pMIR-Luc或pMIR-RB1-mut质粒的细胞相对荧光素酶活性[pMIR-Luc:(7.68±1.04);pMIR-RB1-mut:(7.56±0.99)]较相应过表达miR-NC组[pMIR-Luc:(7.86±0.73);pMIR-RB1-mut:(7.82±1.05)]无显著差异;上调miR-192水平显著降低HepG2细胞中内源性RB1 mRNA[(0.56±0.10)vs (1.05±0.13)]和蛋白(47% vs 100%)的表达.结论 RB1基因是miR-192的一个靶基因,在HepG2细胞中,miR-192通过直接结合RB1 mRNA 3′UTR而负性调控RB1基因表达.     

基于miRNA-mRNA网络筛查并验证胃癌诊断和预后评估相关的标志物及其潜在分子机制

目的：通过生物信息学方法探索并实验验证胃癌相关标志物miR-1-3p对胃癌细胞增殖的作用及其分子机制。方法：收集TCGA数据库中胃癌（n=375）及癌旁组织（n=45）的转录组数据,构建胃癌特异性mRNA-miRNA网络,筛选潜在的miRNA类标志物,利用TargetScan预测标志物的下游靶基因且分析它们的功能。选取人正常胃上皮细胞GES-1及胃癌细胞AGS、MKN45、NCI-N87,用q PCR法检测细胞中miR-1-3p和心肌蛋白（MYOCD）的表达,用lipofectamine 2000将miR-1-3p模拟物转染至胃癌细胞中,CCK-8法测定轨染后细胞的增殖能力,WB法测定MYOCD的表达量,双荧光素酶报告基因实验验证miR-1-3p与MYOCD之间的靶向结合关系。结果：通过数据库数据分析得到差异表达的259个miRNA和7 545个mRNA,构建胃癌特异性mRNAmiRNA调节网络,分析网络中脆弱结构后确定miR-1-3p为潜在的胃癌标志物,ROC曲线和Kaplan-Meier分析显示其对胃癌的诊断和预后评估有重要意义。细胞实验显示miR-1-3p在胃癌细胞中呈低表达（P...