miR-135a-5p抑制胆囊癌细胞增殖的研究

目的:探讨miR-135a-5p对胆囊癌的作用及其机制。方法:采用实时PCR检测miR-135a-5p和VLDLR在23对胆囊癌与癌旁组织的表达。采用miR-135a-5p模拟物转染胆囊癌细胞,通过细胞增殖(CCK-8)曲线、单克隆集落形成实验和细胞周期实验(流式细胞仪),检测miR-135a-5p对胆囊癌细胞增殖的影响。用Western印迹和Luciferase双荧光素酶报告系统验证和VLDLR受miR-135a-5p的调控。结果:在23对胆囊癌与癌旁组织中,癌组织的miR-135a-5p表达水平低于癌旁组织。体外实验证实miR-135a-5p通过G1期阻滞抑制胆囊癌细胞的增殖,且可通过作用于VLDLR mRNA降低其蛋白质水平。结论:miR-135a-5p抑制胆囊癌的增殖,可能是胆囊癌治疗靶点。     

卒中后抑郁患者血浆中miR-30a-5p的差异性表达及其作用机制的生物信息学预测

目的 探讨卒中后抑郁（PSD）患者miR-30a-5p的表达差异性及其在PSD中的诊断价值,基于生物信息学方法,分析其可能作用机制。方法 检索PubMed数据库,利用VENNY2.1在线软件获取到目标microRNA。贯续性纳入2018年10月~2019年3月就诊于皖南医学院弋矶山医院神经内科卒中病房并首次诊断为急性脑梗死的患者,收集患者入院时人口统计学资料、卒中危险因素、既往卒中病史、美国国立卫生研究院脑卒中量表（NHISS）评分等临床基线资料及影像学资料,并与入院当天留取研究对象外周静脉血5 mL。随访3个月根据Hamilton 抑郁量表（HAMD-17）行抑郁程度的评价,对于评分值≥7 者按照《美国精神病学会叶精神疾病诊断与统计手册》第4 版（DSM-IV）诊断标准诊断抑郁,分为PSD组（n=11）和non-PSD组（n=25）。使用qRT-PCR法检测卒中后抑郁患者（PSD）和非卒中后抑郁患者（NPSD）外周血miR-30a-5p表达水平,利用ENCORI数据库和CTD（Comparative Toxicogenomics Database）数据库共同预测和筛选miR-30a-5p调控的抑郁相关可能作用的靶基因,通过生物信息学方法对靶基因的可能作用机制进行进一步分析。结果 通过交叉筛选得到同时与卒中和抑郁相关的 miR-30a-5p,临床样本 qRT-PCR 验证 miR-30a-5p 在 PSD 和 non-PSD 组有差异性表达（2.462±0.326 vs 1±0.126,P<0.0001）。ROC曲线分析提示miR-30a-5p预测PSD的AUC=0.869（95%CI,0.745-0.993,P=0.0005）,cut-off值为1.597,对应的敏感性和特异性分别为0.727、0.840。靶蛋白主要作用的生物学过程包括信号转导、细胞间通讯、核酸碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢的调节;KEGG通路富集分析发现,靶蛋白主要作用于神经营养素信号通路、轴突导向信号通路、胰岛素信号传导系统;经过CytoHUBBA分析得出可能与卒中后抑郁相关的前20种HUB基因。结论 外周血miR-30a-5p在卒中后抑郁患者和非卒中后抑郁患者中存在差异性表达,可以作为诊断PSD的临床标志物,其可能是通过神经营养素信号通路、轴突导向信号通路、胰岛素信号传导系统来影响PSD的发生。     

生物信息学在三阴性乳腺癌mi RNA生物标志物筛选中的应用

目的：通过医学癌症数据库（TCGA）和基因表达数据库（GEO）分析三阴性乳腺癌（TNBC）中差异表达微小RNA（miRNAs）并预测其靶基因,探讨其生物学功能和分子机制,寻找TNBC预后相关靶点。方法：下载TCGA数据库中343项关于乳腺癌组织与癌旁组织相关的miRNAs表达数据,筛选乳腺癌与癌旁组织中差异表达的miRNAs;GEO数据库验证miRNAs在TNBC细胞系的26种细胞株中的表达以及TNBC患者经过化疗前后血清中miRNAs的变化;通过基因本体（GO）功能注释及京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路富集、蛋白质互作网络分析候选miRNAs的靶基因功能。结果： TCGA数据库,在乳腺癌组织中的miR-21-5p表达水平明显高于相邻癌旁组织（logFC=5.557,P<0.01）;GEO数据库筛选,miR-21-5p在TNBC细胞系中表达水平明显升高,在26种TNBC细胞株中超过20种细胞株相对表达水平>70 000,TNBC患者经联合化疗后miR-21-5p的表达水平明显降低（logFC=-5.07,P<0.01）;GO分析,miR-21-5p主要在DNA复制、转录以及血管重构等方面发挥调控作用;KEGG富集分析,miR-21-5p主要通过促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和转化生长因子β（TGF-β）等通路影响TNBC的发生发展。结论： miR-21-5p在TNBC组织中表达上调,在TNBC进展中发挥正调控作用,可能成为鉴定TNBC相关预后程度的关键生物学标志物。DUSP8等可能作为miR-21-5p的靶基因参与调控TNBC的发生发展。     

miR-34a在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

【目的】观察miR-34a在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用并探讨其可能的机制。【方法】原代分离和培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）,并给予3%低氧处理后,用Real-time PCR法检测miR-34a和Notch1mRNA在大鼠PASMC中的表达;低氧条件下用细胞转染法过表达和抑制miR-34a、沉默Notch1基因的表达后用EDU法观察细胞增殖情况,并用Real-time PCR和Western blot法检测细胞核增殖抗原PCNA的表达。【结果】分离和培养大鼠PASMC并给予3%低氧处理后,大鼠PASMC中miR-34a表达明显降低,且低氧48h降低较明显,组间差异有统计学意义（P<0.05）。而Notch1的表达明显增高,且48h增高较明显,组间差异有统计学意义（P<0.05）。此外,过表达miR-34a和沉默Notch1后会显著抑制低氧引起的细胞增殖,抑制miR-34a的表达后则会促进细胞增殖,且组间差异有统计学意义（P<0.05）。【结论】在低氧诱导的PASMC细胞增殖过程中miR-34a参与了PASMC的增殖过程,且可能是通过上调Notch1引起了细胞增殖。     

MiR-199a-3p在胰腺癌中的表达水平及生物信息学分析

目的:探讨miR-199a-3p在胰腺癌中的表达水平及作为胰腺癌的诊断指标的意义,并进行生物信息学分析。方法:从GEO数据库收集胰腺癌和正常胰腺组织中miR-199a-3p的数据。汇总数据绘制受试者工作特征曲线,进行Meta分析,采用生物信息学方法预测miR-199a-3p的靶基因,并对靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。结果:收集到6个GEO数据,4个数据的ROC曲线表现出显著的诊断意义,Meta分析结果显示miR-199a-3p在胰腺癌中表达水平高于正常胰腺组织,差异有统计学意义（P<0.001）。预测到221个miR-199a-3p潜在的靶基因,其功能主要富集在基因表达的调控,细胞代谢的调控,蛋白质域特异性结合等生物学过程（P<0.001）,KEGG分析结果显示主要集中在PI3K-Akt通路、黏着斑、肌动蛋白细胞骨架调控、癌症通路、Hippo通路、鞘脂通路、ErbB通路、MAPK通路等通路（P<0.05）。结论:相比正常胰腺组织,miR-199a-3p在胰腺癌为高表达,可作为胰腺癌的一个潜在诊断指标,并可能在胰腺癌的发生发展中起到重要作用,为胰腺癌的研究和治疗提供了新的方向。     

miR-181a靶向作用CARF基因抑制胰腺癌细胞凋亡

目的：探讨miR-181a与CARF基因是否存在靶向关系,并研究其在调节胰腺癌细胞增殖凋亡过程中的作用。方法：利用Real-time PCR检测胰腺癌组织细胞中miR-181a的表达水平,通过miR-181a拮抗剂下调胰腺癌细胞中miR-181a浓度,并用MTT检测其细胞增殖能力变化。建立包含CARF基因3’-UTR序列的PGL-3载体,结合双荧光素酶报告基因系统验证CARF基因是否存在miR-181a的作用靶点,然后通过激动剂及拮抗剂调节胰腺癌细胞中miR-181a浓度,用Western blot检测相应细胞CARF基因蛋白表达情况。结果：miR-181a在胰腺癌组织/细胞中的表达水平明显高于正常胰腺组织/细胞（P＜0.05）。转染miR-181a拮抗剂可显著下调胰腺癌细胞中miR-181a的表达,并使其增殖能力明显下降（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因系统提示miR-181a与包含CARF基因3’-UTR序列的载体共转染,可明显下调荧光素酶活性,且下调水平与miR-181a剂量呈负相关（P＜0.05）;CARF蛋白表达情况和胰腺癌细胞中miR-181a水平呈显著负相关（P＜0.05）。结论：miR-181a在胰腺癌细胞中存在高表达,通过下调CARF靶基因促进细胞增殖而推动胰腺癌的发展。     

miR-202通过降低肝癌细胞ROCK1表达抑制其迁移和侵袭

目的：研究微小RNA-202（miR-202）对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,并探讨其可能的分子机制。方法：通过实时定量PCR检测Hep3B、Huh7及HCCLM3人肝癌细胞和LO2人正常肝细胞中miR-202的表达水平。以miR-202表达水平最低的HCCLM3细胞为转染对象,转染miR-202模拟物或空白对照miRNA,以miR-202表达水平最高的Hep3B细胞为转染对象,转染miR-202抑制物或阴性对照miRNA,并利用实时定量PCR验证转染效率。采用Transwell迁移和侵袭实验检测过表达和敲低miR-202对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。生物信息学网站检索并应用荧光素酶报告基因实验验证miR-202的靶基因。实时定量PCR和Western blot检测miR-202靶基因的表达水平。结果：与正常肝细胞LO2相比,miR-202在肝癌细胞的表达水平显著降低;HCCLM3细胞转染miR-202模拟物后,细胞miR-202的表达水平显著增加;过表达miR-202后,HCCLM3细胞的迁移和侵袭能力显著降低;Hep3B细胞转染miR-202抑制物后,细胞miR-202的表达水平显著降低;敲低miR-202后,Hep3B细胞的迁移和侵袭能力显著增强;生物信息学检索及荧光素酶报告基因证明ROCK1基因为miR-202的靶基因。过表达miR-202可明显降低肝癌细胞中ROCK1基因的表达,而敲低miR-202可明显增加肝癌细胞中ROCK1基因的表达。结论：miR-202在肝癌细胞中低表达,miR-202通过抑制ROCK1的表达抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。     

miR-145antagomir转染的脂肪间充质干细胞对野百合碱诱导的肺动脉高压的作用

目的：研究miR-145 antagomir转染脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cell,ASC）在野百合碱（monocrotaline,MCT）诱导的大鼠肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）中的作用。方法：建立大鼠PAH模型,随机分为空白对照组（对照组）、MCT造模组（MCT组）、正常ASC注射组（ASC组）、antagomir转染组（antagomir组）和antagomir空载体转染组（antagomirNC组）,分别进行不同处理的ASC移植。2周后测量大鼠右心室压力（right ventricular systolic pressure,RVSP）,取心脏组织和左肺上叶组织进行作病理检查,测量右心室肥厚指数（right ventricle-to-left ventricle+septum,RV/LV+S）、心肌细胞相对横截面积（cross-sectional area,CSA）和肺小动脉内膜+中膜厚度（medial wall thickness+intimal thickness,MT+IT）。结果：病理检查显示antagomir组肺小动脉内膜较MCT组明显变薄。RVSP：ASC组RVSP为22.48±2.67 mmHg,antagomir组为18.77±2.14 mmHg,antagomir NC组为21.92±2.77 mmHg,均低于MCT组的26.85±3.03 mmHg,差异均有统计学意义（P<0.05）,其中antagomir组RVSP降低最明显。RV/LV+S和CSA：ASC组分别为0.33±0.04和349.83±14.21 μm2,antagomir组分别为0.26±0.03和320.67±18.23 μm2（P<0.001）,antagomir-NC组分别为0.3±0.03和356.83±15.36 μm2,均低于NCT组的0.4±0.026和396.33±21.25 μm2,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：miR-145 antagomir转染的ASC可以延缓PAH的进展,为PAH提供了一个潜在的治疗方向。     

食管鳞状细胞癌患者microRNA-127-3p 的 表达水平及临床意义

目的 探讨miR-127-3p 在食管鳞状细胞癌（ESCC）中的表达及其临床意义。方法 选取 2013 年2 月—2015 年2 月于湖南省人民医院和长沙市中心医院行外科手术的80 例ESCC 患者癌组织及癌 旁组织标本,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-127-3p mRNA 相对表达量,利用免疫组织化学法 检测SKI 蛋白在患者癌组织及癌旁组织标本中的表达,并对所有患者进行≥ 3 年的随访。同时检测ESCC 细 胞株Eca109 和Kyse150 及正常人食管上皮细胞株Het-1a 中miR-127-3p 的表达水平。结果 免疫组织化 学染色结果表明,癌组织中SKI 蛋白表达阳性率较癌旁组织升高（P <0.05）;ESCC 细胞株Eca109、Kyse150 中miR-127-3p 相对表达量低于正常人食管上皮细胞株Het-1a（P <0.05）;临床分期Ⅲ期患者miR-127- 3p 低表达率高于Ⅰ期和Ⅱ期（P <0.05）,有淋巴结转移和饮酒史患者miR-127-3p 低表达率高于无淋巴 结转移和无饮酒史患者（P <0.05）,miR-127-3p 低表达患者的中位无进展期较高表达患者短（P <0.05）。 结论 miR-127-3p 通过靶向调控SKI 蛋白的表达参与ESCC 的发生,其低表达可能参与ESCC 的侵袭及转 移过程,并显著影响患者的预后。     

miR-186海绵载体的构建及其在EA.hy926细胞株中的表达

目的：构建微小RNA-186（miR-186）基因的海绵载体,建立稳定敲减miR-186的EA.hy926细胞株。方法：化学合成miR-186海绵体序列,并克隆到慢病毒FV040表达载体上;采用lipofectamine 2000共转染FV040-miR-186-sponge载体和慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞,包装慢病毒,测定病毒滴度;FV040-control慢病毒作为对照组,FV040-miR-186-sponge作为实验组,分别感染EA.hy926细胞,筛选稳转细胞株;采用荧光定量PCR （qPCR）法检测空白对照组、FV040-control对照组及FV040-miR-186-sponge实验组中EA.hy926细胞miR-186的相对表达水平。结果：测序结果显示克隆的目的基因序列与设计的miR-186海绵体序列完全一致。在感染的EA.hy926细胞中观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达。FV040-control包装的慢病毒滴度为2×10⁸ TU·mL^-1,FV040-miR-186-sponge组慢病毒滴度为6×10⁸ TU·mL^-1;成功建立了稳定表达miR-186-sponge的EA.hy926细胞株,感染效率达95%;qPCR检测,与空白对照组和FV040-control组比较,FV040-miR-186-sponge组EA.hy926细胞中miR-186相对表达水平降低（P<0.01）。结论：成功构建了miR-186基因的海绵载体,建立了稳定下调miR-186表达的EA.hy926-miR-186-sponge细胞株。