多药耐药基因的人骨髓细胞转染及其对抗癌药的抗性增强作用

为探讨mdrl基因转染增强人骨髓细胞对抗癌药的抵御能力的可能性.通过脂质体介导,用含人mdrlcDNA表达质粒pHaMDR1/A,将mdrl基因转染人骨髓细胞,分别采用流式细胞术和免疫组化检测转染细胞mdrl基因的表达产物--P糖蛋白(Pgp),并用罗丹明试验证实其生物活性.同时,采用集落培养及抗性试验检测mdrl基因转染的人骨髓细胞对阿霉素、秋水仙碱、长春新碱和Vp16的抵御能力.结果mdrl基因被成功地导入了人骨髓细胞并获得了表达,罗丹明试验证实了Pgp具有完整的生物功能.mdrl基因转染的人骨髓细胞对上述抗癌药的抵御能力明显增强.     

姜黄素对耐药细胞株K562/ADM的耐药逆转作用研究

目的:研究姜黄素对慢性粒细胞白血病多药耐药细胞株K562/ADM中多药耐药基因mdrl表达的下调作用.方法:采用RT-PCR和Western blot方法检测各处理组K562/ADM细胞株中mdrl基因表达;利用MTT试验检测姜黄素处理后K562/ADM细胞株对阿霉素敏感性的改变.结果:姜黄素抑制了K562/ADM细胞株中多药耐药基因mdrl的表达,姜黄素明显增加K562/ADM细胞株对阿霉素的敏感性.结论:姜黄素通过抑制P-gP的药物外排作用有效逆转K562/ADM细胞株的多药耐药性.     

RNA干扰逆转白血病细胞耐药性的研究

目的 用RNA干扰技术下调白血病耐药细胞系K562/A02多药耐药基因mdr1的表达以逆转白血病对化学药物的耐药性.方法 针对mdr1基因已知mRNA序列不同位点,选择两条靶序列,构建靶向mdr1 shRNA真核表达载体,脂质体介导转染白血病耐药细胞株K562/A02.实时荧光定量RT-PCR检测mRNA表达,Western blot检测细胞膜P-gp表达,柔红霉素泵出试验检测P-gp外排泵功能,MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性.结果 构建了二条针对mdr1基因的shRNA真核表达载体,分别下调mdr1 mRNA的表达89.74%和87.18%,降低细胞膜P-gp表达,使膜外泵功能明显下降,柔红霉素在细胞内贮留明显增多,60min 时柔红泵出率为13.16%、22.02%,对照组为40.44%、45.31%,对阿霉素药物敏感性的相对逆转率为84.36%和76.69%.结论 RNA干扰技术可有效逆转mdr1所致耐药.     

Primary Pulmonary Responses to Toxic Agents

Abstract

Many aquatic organisms thrive and reproduce in polluted waters. This fact indicates that they are well equipped with a defense system(s) against several toxic xenobiotics simultaneously because water pollution is typically caused by a mixture of a number of pollutants. We have found that the biochemical mechanism underlying such “multixenobiotic” resistance in freshwater and marine mussel, in several marine sponges, and in freshwater fish is similar to the mechanism of multidrug resistance (MDR) found in tumor cells that became refractory to treatment with a variety of chemotherapeutic agents. All these organisms possess a verapamil-sensitive potential to bind 2-acetylaminofluorene and vincristine onto membrane vesicles. They all express mRNA formdr 1 gene, andmdr 1 protein product, the glycoprotein P170. Finally, inin vivo experiments, the accumulation of xenobiotics is enhanced in all investigated organisms in the presence of verapamil, the inhibitor of the P170 extrusion pump. The knowledge that the presence of one xenobiotic may block the pumping out, and hence accelerating accumulation, of others, may help us to understand and interprete our present and past data on different environmental parameters obtained using indicator organisms.     

慢病毒载体介导Mdr1基因转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

本研究探讨多药耐药（mdr1）基因体外转染人骨髓间充质干细胞（BMMSC）以应用于基因治疗的可行性、安全性。体外分离、培养、鉴定MSC;采用具有高效转染非分裂期细胞的慢病毒载体（1entiviralvector,LV）系统将mdr1基因导入BMMSC中;采用RT—PCR和GFP荧光技术检测目的基因的表达,台盼蓝染色及MTT法检测转染后细胞的增殖能力。结果表明：慢病毒感染MSC的感染复数（multiplicityofinfection,MOI）为10,最佳感染率可达80％;Msc表面低表达CD34、HLA—DR、CD31、CD45,高表达CD44、CDl05、CD90、CDl3;GFP荧光表达自72小时开始出现,以后逐渐增强;转染细胞中显示目的基因mRNA的表达;转染对MSC存活及增殖几乎无影响（P〉0．05）。结论：慢病毒载体可成功转染人骨髓间充质干细胞并使其mdrl表达增高,转染对MSC存活及增殖基本无影响。     

X射线照射K562细胞后mdrl基因表达和白血病干细胞含量的变化

目的研究白血病K562细胞经x射线照射后耐药基因mdrl表达、白血病干细胞（LSC）含量和药物敏感性的变化,探讨自血病辐射耐受性与药物耐受性的相关性。方法以白血病K562细胞为模型,直线加速器x射线照射,采用实时荧光定量PCR技术检测mdrlmRNA表达,流式细胞术检测LSC表面标志和P-糖蛋白（P—gP）表达,MTT法测定细胞的药物敏感性。结果白血病K562细胞系mdrl基因表达和LSC含量极低,经不同剂量的x射线照射后,K562细胞中LSC的含量显著增加,mdrl／P-gP表达增高,随时间延长而逐渐降低;对阿霉素的敏感性明显降低。结论x射线照射可提高白血病K562细胞群中LSC的比例和刺激mdrl／P—gP表达,继发性地降低其对常规化疗药物的敏感性。     

FLT3-ITD突变在儿童急性髓性白血病中的表达及其与多药耐药的关系

为了研究FLT3内部串联重复序列（FLT3-ITD）突变在儿童急性髓系白血病（AML）中的表达、该类患儿的临床特征及其与多药耐药基因mdr1表达的关系,应用RT—PCR技术检测81名初发儿童AML骨髓标本,FLT3-ITD突变及mdr1基因的表达,并分析患儿骨髓细胞遗传学及免疫表型。结果表明：在AML患儿中FLT3-ITD突变率为9．88％（8／81）,均为杂合突变。突变患儿年龄较无此突变者明显偏大,但与性别、细胞免疫分型等无关。突变组就诊时白细胞数及骨髓原始细胞数较无突变组显著升高（P=0．001和P=0．041）,且突变组患儿表现为正常染色体居多。突变组患儿预后较差,首次诱导缓解率仅为25．00％,而无突变组为76．71％。RT—PCR法检测mdr1基因显示,27名患儿表达该基因,但在FLT3-ITD阳性的8名患儿中只有3人是同时表达mdr1基因,此结果提示FLT3-ITD发生与多药耐药基因的表达无相关性。结论：FLT3-ITD突变是儿童AML中发生频率较高的一类突变,但突变率较成人为低,此类患儿预后差,首次诱导缓解率低,但FLT3-ITD突变与多药耐药基因的表达无相关性,提示耐药调节剂可能对该类患儿无效。     

mdr1基因shRNA表达载体逆转白血病耐药细胞系K562/ADM多药耐药的实验研究

目的 探讨mdr1短发夹RNA（mdr1 shRNA）对人红白血病耐阿霉素细胞系K562／ADM的耐药逆转作用。方法 编码设计合成靶位mdr1基因mRNA具有19个碱基发夹结构互补的寡核苷酸模板，构建2个shRNA表达载体pSilencer^Tm3．1-H1 neo mdr1—A和mdr1—B，将其稳定转染K562／ADM细胞。用RT—PCR法检测转染后K562／ADM细胞mdr1 mRNA表达，Western blot检测P-糖蛋白（P—gP）表达，流式细胞术和MTT法分别检测K562／ADM细胞凋亡和对阿霉素的敏感性，用激光共聚焦荧光显微镜观察并测定细胞内柔红霉素的积累。结果 在pSilencer^TM3．1-H1 neomdr1—A和mdr1—B shRNA表达载体稳定转染的K562／ADM细胞，mdr1mRNA表达分别减少到转染前的35．9％（P〈0．05）和27．5％（P〈0．01）；同时Western blot结果显示P—gP表达被明显而特异地抑制，对阿霉素的耐药性由79倍分别减低到38倍和30倍；并且，细胞内荧光强度与对照组相比显著增加（P〈0．05），与阿霉素联合应用凋亡细胞百分率分别增加至18．1％（P〈0．05）和54．4％（P〈0．01）。结论 靶向mdr1基因shRNA表达载体可有效逆转耐药，使耐药的肿瘤细胞恢复对化疗药物的敏感性。     

硼替佐米对伊马替尼耐药细胞系K562/G01药物敏感性的影响

目的 探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米对伊马替尼耐药细胞系(K562/G01)药物敏感性的影响及作用机制.方法 采用MTT法观察伊马替尼单用与联用硼替佐米对K562/G01细胞增殖的影响.流式细胞技术检测细胞周期的变化.实时荧光定量PCR检测COX-2、多药耐药(mdr1)基因的表达.结果 联合10、20 nmol/L硼替佐米能明显增强K562/G01细胞的伊马替尼药物敏感性,逆转倍数分别为1.83、2.72倍,进一步计算表明两药联合具有协同作用.流式细胞技术检测显示硼替佐米作用后细胞周期向G2/M期转化.实时荧光定量PCR检测显示K562/G01细胞高表达的COX-2和mdr1基因,硼替佐米作用后均表达下调.结论 硼替佐米能增强K562/G01细胞对伊马替尼的敏感性,其机制可能与细胞周期的G2/M期阻滞,抑制COX-2和mdr1的表达有关.

Abstract：

Objective To explore the effect of bortezomib ( BOR) on the drug sensitivity of imatinibresistant chronic myeloid leukemia cell line K562/G01 cell and its mechanism. Methods MTT assay was used to detect the inhibition effect of cell growth, flow cytometry to cell cycle, and real time-PCR to the expression of COX-2 and mdrl mRNA. Results Combination of 10 and 20 nmol/L BOR with imatinib could significantly enhance the sensitivity of K562/G01 to imatinib, the reverse factor was 1. 83 and 2.72-fold respectively. Cell cycle arrested at G2/M phase could be observed by flow cytometry on BOR treatment. The over-expression of COX-2 and mdrl could be down-regulated by BOR. Conclusions BOR can enhance the imatinib sensitivity of imatinib resistant K562/G01 cell. The mechanism may be related to cell cycle phase arrested at G2/M and down-regulation of COX-2 and mdrl expression.     

携带人多药抗性基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

从ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ质粒用ＸｈｏⅠ和ＳａｃⅡ将ｍｄｒｌ基因切下后克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒的相应酶切位点获得测序质粒ｐＢＳｍｄｒｌ，测定了ｍｄｒｌ基因的两端序列。用ＥｃｏⅠＣＲＩ和ＸｈｏⅠ从ｐＢ－Ｓｍｄｒｌ切下ｍｄｒｌ基因，定向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ和ｐＭＳＣＶ２．１，得到携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒载体ｐＬｍｄｒｌＳＮ和ｐＭＳＣＶｍｄｒｌ。用ＰＡ３１７病毒包装细胞包装后三种携带ｍｄｒｌ基因的病毒具有相似的滴度。用此三种病毒分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞后，以ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ载体ｍｄｒｌ基因产物表达量最高。提示Ｈａｒｖｅｙ肉瘤病毒的启动子可能具有较高的强度。