Stathmin和CrkL蛋白在耐阿霉素的K562白血病细胞中表达上调

本研究应用蛋白质组学方法比较白血病K562细胞及其耐阿霉素的K562/A02细胞中蛋白质表达谱的差异,筛选新的耐药相关蛋白。利用荧光差异双向电泳（2D-DIGE）技术分离K562细胞及K562/A02细胞的总蛋白,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）对差异表达蛋白质点进行鉴定,搜索蛋白质数据库,获得差异蛋白质的信息,并用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR法在蛋白质水平和mRNA水平对差异蛋白质进行验证。结果显示,经过DIGE技术和质谱分析,鉴定出8个蛋白质在耐阿霉素的K562细胞中表达有差异,其中2个表达下调,6个表达上调,它们分别参与细胞能量代谢、细胞增殖、细胞凋亡、细胞信号转导和基因转录等。在表达上调的蛋白中挑选Stathmin和CrkL蛋白,在K562及其耐药细胞株中进行了蛋白免疫印迹实验,结果与双向电泳结果一致;实时荧光定量PCR显示,CrkL在mRNA水平变化与在蛋白质水平变化一致,而Stathmin在mRNA水平变化与蛋白质水平变化不完全一致。结论：白血病K562细胞及其耐阿霉素K562/A02细胞蛋白质表达谱有差异,Stathmin和CrkL蛋白可能与耐药有关,值得进一步探讨。     

磷酸肌酸对阿霉素致大鼠心肌损伤的保护作用及其抗细胞凋亡的实验研究

目的通过建立大鼠阿霉素心肌损伤模型,观察磷酸肌酸对阿霉素心肌损伤的保护作用,并研究磷酸肌酸抑制心肌细胞凋亡的机制。方法采用随机分组的方法将40只SD大鼠分为4组。（1）对照组：腹腔注射生理盐水每日一次;（2）阿霉素组：隔日一次腹腔注射阿霉素建立阿霉素心肌损伤模型。（3）阿霉素＋磷酸肌酸钠组（小剂量）：隔日一次腹腔注射磷酸肌酸钠（200mg/kg）,30min后注射阿霉素。（4）阿霉素＋磷酸肌酸钠组（大剂量）：隔日1次腹腔注射磷酸肌酸钠（300mg/kg）,30min后注射阿霉素。用药结束后测定各组大鼠血清、心肌组织中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性,血清中肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量变化。取心肌组织HE染色,观察大鼠心肌病理形态学变化。免疫组织化学染色方法检测各组心肌组织中BAX、BCL-2蛋白表达情况。结果两组加入磷酸肌酸钠大鼠脂质过氧化产物MDA含量减少,心肌抗氧化酶SOD及CAT活性增加,血清中CK、CK-MB含量减少,与阿霉素组比较有统计学意义（P〈0.05）。免疫组化结果显示,磷酸肌酸钠组大鼠心肌促凋亡蛋白BAX表达减弱,抗凋亡蛋白BCL-2表达增强,且与阿霉素组比较有意义（P〈0.05）。给予不同剂量磷酸肌酸钠的两组大鼠,各项检测指标未见差异（P〈0.05）。结论磷酸肌酸通过增强抗氧化酶系统的功能,降低阿霉素引起的氧化应激损伤,抑制自由基引起的心肌细胞凋亡,起到保护心脏功能的作用。     

阿霉素肾病小鼠病理机制中白细胞介素-18水平分析

目的探讨白细胞介素-18(IL-18)在阿霉素肾病模型(微小病变型肾病,MCN)小鼠病程中的免疫失调作用。方法采用阿霉素单次尾静脉注射昆明种小鼠,诱导形成微小病变型肾病模型,设置模型组、生理盐水对照组和IL-18mAb抗体中和实验组(mAb)。测定3组小鼠第1、2、4、6周24h尿蛋白(24hUPQ)水平;于第42天时心脏采血法留取血清,检测模型组与对照组血清总蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(Tch)的水平;取单侧肾做病理检测,同时制备脾淋巴细胞悬液、肾组织匀浆液检测3组IL-18、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及IL-4水平。结果模型组小鼠从注射阿霉素第2周起,24hUPQ值均高于对照组,差异均有统计学意义(P0.01);血清TP、ALB、BUN、Cr、Tch、TG结果和病理诊断结果显示,模型小鼠出现低蛋白血症、高脂血症等类肾病综合征症状。检测显示模型组小鼠血清、肾组织匀浆上清液、脾淋巴细胞培养上清液IL-18、INF-γ、TNF-α水平均高于对照组,而IL-4水平均低于对照组,组间比较差异均有统计学意义(P0.01)。mAb组小鼠24hUPQ及IL-18、IFN-γ、TNF-α水平均低于模型组,组间比较差异有统计学意义(P0.01)。结论模型小鼠病程中,Th1类细胞因子分泌增强,Th2类因子受抑制,且IL-18mAb起到部分中和内源性IL-18的作用,表明IL-18是小鼠MCN病程中重要的免疫失调因子。     

热疗联合阿霉素和TRAIL对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的:观察热疗（hyperthermia,HT）联合亚浓度阿霉素(adriamycin,ADM)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL）对肝癌HepG2细胞凋亡的影响,以确定联合方案是否具有协同作用。方法:采用CCK8法检测细胞的活性;Hoechst 33258染色实验检测细胞的形态变化;流式细胞仪检测细胞的凋亡;Western blot实验检测细胞内蛋白的表达水平。结果:HT联合ADM和TRAIL可明显抑制肝癌HepG2细胞的活性（P＜0.05）,促进细胞染色质浓缩、核碎裂。流式细胞检测结果表明,HT联合ADM和TRAIL可促进细胞的早期凋亡（P＜0.001）和晚期凋亡（P＜0.01）。Western blot实验进一步证明,HT联合ADM和TRAIL通过上调DR4、DR5、caspase-3和caspase-8蛋白的表达来促进细胞的凋亡（P＜0.05）。结论:HT联合ADM和TRAIL具有协同作用,可明显增加细胞凋亡的敏感性,促进肝癌细胞的凋亡。     

生长激素对大鼠阿霉素性心肌病心肌细胞凋亡的影响

目的探讨生长激素（Growth hormone，GH）对大鼠阿霉素（Adriamycin，ADR）心肌病心肌细胞凋亡及其相关基因蛋白BCL-2、BAX表达的影响。方法30只雄性Wistar大鼠，体重200—250g，随机分为3组：对照组、ADR组和GH＋ADR组。用原位末端标记法（TUNEL）标记凋亡的心肌细胞，用免疫组织化学方法检测BAX和BCL-2的蛋白表达。结果与对照组比较，ADR组心肌细胞凋亡指数明显升高（P〈0．05），GH＋ADR组细胞凋亡指数低于ADR组（P〈0．05）。ADR组BAX蛋白表达明显高于对照组（P〈0．05），BCL-2蛋白表达明显低于对照组（P〈0．05）。GH＋ADR组BAX的蛋白表达明显低于ADR组（P〈0．05），但高于对照组（P〈0．05）；BCL-2的蛋白表达明显高于ADR组（P〈0．05），接近对照组。结论心肌细胞凋亡是导致阿霉素心肌病的主要原因，GH干预治疗可减少阿霉素心肌病的心肌细胞凋亡，这可能与GH能提高BCL-2/BAX比值有关。     

咯萘啶逆转人乳腺癌MCF-7/ADM细胞耐药性及机制探讨

目的 在明确咯萘啶(PND)逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADM耐药性的药效基础上,初步探索作用机制。方法采用MTT法检测单用阿霉素(ADM)和联用咯萘啶(PND)对人乳腺癌敏感细胞MCF-7和耐药细胞MCF-7/ADM的抑制作用,得出半数抑制浓度(IC₅₀),并计算耐药倍数和逆转倍数。Western blot检测细胞中Fas和Caspases-3蛋白表达。结果ADM对MCF-7和MCF-7/ADM的IC₅₀分别为1.399 μg/mL和43.885 μg/mL,耐药倍数为31.4倍。PND(0.5 μg/mL)联合ADM作用MCF-7/ADM的IC₅₀为3.246 μg/mL,逆转倍数为13.5倍,并能提高耐药MCF-7/ADM中Fas和Caspases-3蛋白表达。结论PND能够逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADM耐药性,通过上调膜蛋白Fas表达,增加MCF-7/ADM对ADM的敏感性,从而促进细胞凋亡。     

低频超声联合微泡对比剂通过PI3K/AKT通路对乳腺癌耐药株MCF-7/ADR多药耐药的逆转机制研究

目的 探索低频超声联合微泡（LFUSMB）通过磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路对乳腺癌 耐药株MCF-7/阿霉素（ADR）多药耐药的逆转效果及机制。方法 CCK-8法筛选LFUSMB作用时间并测定ADR对 MCF-7/ADR 细胞的半抑制浓度（IC50）。将 MCF-7/ADR 细胞分组为：对照（C）组,采用 MCF 细胞培养基正常培养; ADR组,采用加入ADR（终质量浓度20 mg/L）的MCF细胞培养基培养;LFUSMB+ADR组,采用加入ADR（终质量浓度 20 mg/L）的MCF细胞培养基培养并经LFUSMB处理30 s;LFUSMB+ADR+740 YP（PI3K/AKT通路活化剂）组,采用加 入 ADR（终质量浓度 20 mg/L）和 740 YP（终质量浓度 50 mg/L）的 MCF 细胞培养基培养并经 LFUSMB 处理 30 s。 Annexin V-FIFC/PI 法检测 MCF-7/ADR 细胞凋亡率,Western blot 检测 P 糖蛋白（P-gp）、抗多药耐药蛋白（MRP）1、 MRP2、乳腺癌抗性蛋白（BCRP/ABCG2）、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白表达。结果 采用LFUSMB干预30 s进行 后续研究。LFUSMB 30 s组ADR对MCF/ADR细胞的IC50低于未超声处理组,相对耐药逆转倍数约为8.20倍。ADR 组细胞凋亡率较C组增高（P＜0.05）,MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT 蛋白水平无明 显变化;LFUSMB+ADR组细胞凋亡率较ADR组增高,MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT 蛋白水平显著下调（P＜0.05）。与 LFUSMB+ADR 组比较,LFUSMB+ADR+740 YP 组细胞凋亡率显著降低,MRP1、 MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白水平显著增高（P＜0.05）。结论 LFUSMB 可通过抑制 PI3K/AKT 通路活化,下调 MRP1等腺苷三磷酸结合盒（ABC）家族蛋白表达,逆转乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药性。     

基于液相质谱技术探讨阿霉素诱导扩张型心肌病潜在血浆标志物

目的：扩张性心肌病是应用阿霉素治疗肿瘤的严重副作用之一,致死率可达50%。通过建立阿霉素扩张型心肌病动物模型对比健康动物,寻找该疾病的生物标志物。方法：采用阿霉素注射法制备扩张型心肌病模型,造模后收集模型组与对照组大鼠的血浆与心肌组织,应用液相质谱技术检测血浆及心肌代谢物,选择共同存在于血浆及心肌组织中的代谢物,并应用ROC曲线进行血浆标志物的筛选。结果：得到45种共同存在于血浆和心肌组织中的差异性代谢物,其中22种代谢物的ROC曲线下面积值（area under the ROC curve,AUC）为1,最佳阈值下的特异性与敏感性均为1。结论：2’-脱氧尿苷等22种差异代谢物对于阿霉素诱导出的中毒性扩张型心肌病具有较强的潜在诊断价值,可能是潜在的生物标志物。     

IR-780联合阿霉素对肝癌干细胞样细胞的杀伤效应研究

目的 探讨七甲川花菁类荧光小分子IR-780联合阿霉素对肝癌干细胞样细胞的杀伤作用.方法 利用CCK-8试剂盒检测不同浓度IR-780(0、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000.μmol/L)及IR-780联合阿霉素(0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 μmol/L)对4种不同肝癌细胞(QGY-7703、SMMC-7721、Huh-7和HepG2)的杀伤效应,并确定后续实验IR-780和阿霉素的浓度,采用细胞划痕实验检测IR-780联合阿霉素对肝癌细胞迁移能力的影响;采用无血清悬浮培养的方法从Huh-7细胞株中分离并鉴定出具有干细胞特性的肿瘤细胞,检测IR-780联合阿霉素对肝癌干细胞样细胞的杀伤作用及迁移能力的影响;在裸鼠皮下荷瘤模型中观察IR-780联合阿霉素对肝癌干细胞样细胞生长的抑制作用.结果 低浓度的IR-780对肝癌细胞无明显杀伤作用;采用1.250 μmol/L的IR-780联合阿霉素可对多种肝癌细胞产生较强的杀伤作用,其中半数致死浓度LC50较单药阿霉素降低25％;采用无血清悬浮培养的方法培养出Huh-7细胞肿瘤球,比较其与贴壁细胞的克隆形成能力、致瘤能力和细胞周期分布,证明悬浮培养的肿瘤细胞具有肿瘤干细胞特性;IR-780联合阿霉素对肝癌干细胞样细胞具有较强的杀伤作用,单用阿霉素和IR-780联合阿霉素对肝癌干细胞样细胞的LC50差异有统计学意义[(0.30±0.02)vs (0.22±0.04) μmol/L,P＜0.05];IR-780联合阿霉素可明显抑制肝癌干细胞样细胞的迁移能力和裸鼠皮下肿瘤的生长.结论 IR-780可增强阿霉素的抗肿瘤作用,提高对肝癌干细胞样细胞的杀伤效应.     

紫苏叶水提物对阿霉素致HK-2细胞氧化损伤的保护及机制

目的:探讨阿霉素(ADR)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)发生氧化损伤后,紫苏叶水提取物(PFAE)对其细胞活性、氧化损伤标记物及细胞凋亡等关键因子的影响。方法:ADR刺激HK-2细胞建立损伤模型,使用N-乙酰半胱氨酸(NAC)或不同浓度PFAE(5,15,45 g·L~(-1))干预后,采用细胞增殖/毒性检测(CCK-8)法检测细胞存活率,结合光镜下细胞形态变化,筛选出PFAE保护细胞的最佳浓度。后续实验分为6组:空白组,ADR(0.05 g·L~(-1))组,PFAE(15 g·L~(-1))组,ADR+PFAE(0.05+15)g·L~(-1)组,NAC(0.81 g·L~(-1))组,ADR+NAC(0.05+81)g·L~(-1)组。检测细胞匀浆中的丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)和细胞总抗氧化能力,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平,流式细胞术及脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TUNEL)染色法检测细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞线粒体凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9和3(Caspase-9,Caspase-3),聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)包括其剪切体的表达,及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路中p38丝裂素活化蛋白激酶(p38 MAPK),细胞外信号调节激酶(ERK),c-Jun氨基端激酶(JNK)及其磷酸化蛋白的表达。结果:与空白组比较,ADR组的细胞活性显著降低(P0.01),与ADR组比较,5,15 g·L~(-1)的PFAE和NAC能促进细胞的增殖(P0.01)。与空白组比较,ADR组抗氧化能力和SOD水平显著降低(P0.01),MDA和ROS的水平显著增高(P0.01),与ADR组比较,ADR+PFAE组和ADR+NAC组抗氧化能力和SOD水平显著升高(P0.01),MDA和ROS的水平显著下降(P0.01)。与空白组比较,ADR组细胞凋亡率上升(P0.01),凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2,cleaved Caspase-9/Caspase-9,cleaved Caspase-3/Caspase-3,cleaved PARP/PARP水平显著上升(P0.01),MAPKs通路中的p38 MAPK,ERK和JNK的磷酸化蛋白表达明显增高(P0.05,P0.01);与ADR组比较,PFAE或NAC干预后减轻了细胞凋亡率,降低了凋亡蛋白的相对比值,并且抑制了MAPK信号通路中p38 MAPK,ERK蛋白的磷酸化(P0.01),但对磷酸化的JNK蛋白表达无影响。结论:PFAE可以减轻ADR诱导的HK-2细胞氧化损伤,并发挥抗氧化作用,通过线粒体凋亡途径和ERK/p38 MAPK信号通路来抑制细胞凋亡。