携带融合基因穿梭质粒的构建及在人肝癌细胞中的表达

构建携带胸苷激酶(tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并观察其在肝癌细胞系HepG2细胞中的表达。应用基因重组技术,构建EGFP与tk的融合表达穿梭质粒载体,经限制酶切鉴定和测序分析,脂质体转染将其导入HepG2中,48h后用荧光显微镜观察荧光的表达,RT-PCR法检测融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染融合蛋白载体后不同浓度的更昔洛韦(GCV)对HepG2细胞的细胞毒作用。酶切鉴定和测序分析证实重组质粒中插入融合目的基因片断及载体DNA大小、方向和插入位点正确,在转染此穿梭质粒的HepG2细胞中检测到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测到融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达;GCV对转染了携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体有明显的细胞毒作用。成功构建携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染人肝癌细胞株HepG2中tk和EGFP的独立表达没有受到影响,该载体可利用绿色荧光蛋白作为报告基因监测tk的表达并可用于肝癌的自杀基因治疗。     

靶向表皮生长因子受体shRNA质粒表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法设计两个小分子干扰RNA（siRNA）序列，体外合成DNA模板引物，与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNA的表达载体，进行酶切鉴定和测序，再转染人大肠癌LoVo细胞，进行荧光摄像和G418抗性筛选。结果构建的质粒表达载体完全符合设计要求，转染成功的细胞在荧光显微镜下显示为绿色，G418可以筛选出阳性克隆。结论成功构建了编码EGFR—shRNA的质粒表达载体，并可以进行稳定筛选。     

龙岩市239株沙门菌毒力基因检测结果分析

目的 了解龙岩市沙门菌毒力基因携带与变迁情况,为沙门菌病的防制提供理论依据。方法 对1991-2017年间收集的分离自人体与食品样本的239株沙门菌进行复核鉴定,并用PCR方法检测invA、sopB、sifA、sscA、sseE、spvB、spvC、spvR、pefA等9个沙门菌毒力基因的片段。结果 龙岩市沙门菌以肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌为主,占62.3%(149/239),属于SPI1的invA、sopB毒力基因检出率为100%,属于SPI2的sseE、sscA、sifA毒力基因的检出率分别为99.2%、95.0%、85.4%,毒力质粒基因spvC检出率71.1%,pefA、spvB、spvR检出率均为46.4%。并且其携带数量也随着时间的进程而显著增加;肠炎沙门菌质粒毒力基因携带率显著高于鼠伤寒沙门菌。肠炎沙门菌以检出全部9种毒力基因为主,占83.5%(76/91);鼠伤寒沙门菌以invA、sopB、sseE、sscA、sifA阳性,spvB、spvR、pefA阴性结果多见,占77.6%(45/58)。人体与食品样本来源的沙门菌所携带毒力基因数量没有差异。结论 龙岩市沙门菌携带毒力基因数量较多,毒力较强,质粒毒力基因随着时间的进程而累积,人源性与食源性沙门菌交叉污染严重,必须加强人、禽、畜沙门菌病的监测与管理。     

脑胶质瘤组织中R132H突变型hIDH1基因双顺反子真核表达载体的构建及鉴定

目的以pcDNA3.1(+)为骨架,构建并鉴定人脑胶质瘤组织中含R132H突变的人源异柠檬酸脱氢酶1基因(hIDH1R132H)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列的双顺反子真核表达载体。方法以内部核糖体进入位点(IRES)/EGFP片段为模板,扩增出IRES/EGFP片段,并在5’末端引入3×Flag标签;通过PCR介导的定点突变法,以pCMV-sports6-hIDH1为模板,扩增hIDH1R132H基因片段,并在3’末端引入3×Flag标签;通过PCR连接两种产物后经双酶切定向克隆入pcDNA3.1(+)骨架;转化大肠杆菌后挑取阳性克隆,提取质粒进行PCR检测及基因序列测定。结果 PCR检测7个菌落中有6个阳性克隆,DNA测序发现引入了hIDH1基因。结论成功构建了双顺反子真核表达载体pcDNA3.1(+)-hIDH1R132H/3×Flag/IRES/EGFP,为研究人胶质瘤组织中R132H突变的作用机制奠定了基础。     

靶向递送人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的:构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM03,并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗.方法:将人GLS,小鼠单链IL-12基因和分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03.以pZM03电转化耻垢分枝杆菌mc2-155,通过PCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒;通过与小鼠巨噬细胞株RAW264.7共孵育检测重组菌的靶向性.结果:成功得到了可靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒pZM03进入巨噬细胞的新型重组菌.结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.     

含弓形虫复合抗原基因的真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的研究弓形虫复合抗原真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B在哺乳动物细胞中的表达情况。方法利用脂质体介导的转染技术,将真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B和空载体pcDNA3.1分别转染He-la细胞,400μg/mlG418加压筛选和200μg/mlG418维持筛选,获得稳定转染的Hela细胞。采用SDS-PAGE和West-ern-blot方法对复合基因P30-P22-CTXA2/B的表达产物进行鉴定。结果SDS-PAGE结果显示,重组质粒转染Hela细胞后的表达产物分子质量单位为64ku,Western-blot显示此蛋白条带能被抗P30抗体识别。结论构建的真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B能在哺乳动物细胞中成功表达插入基因所编码的融合蛋白,为进一步动物实验提供了实验依据。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建

目的 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。方法 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1（＋）,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。结果 扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确。结论 成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。     

靶向XT-1基因shRNA真核表达质粒载体的构建及筛选

目的构建靶向木糖转移酶-1（XT-1）的短发卡状小干扰RNA（shRNA）质粒表达载体;为寻找脊髓损伤治疗的新靶点提供工具。方法设计4个小分子短发卡状RNA（siRNA）序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNAR的表达载体,进行酶切和测序,再转染体外培养的星形胶质细胞,筛选靶序列。结果构建的质粒表达载体完全符合设计要求,转染成功的细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光,G418可以筛选出阳性克隆。结论成功构建了编码XT-1-shRNA的质粒表达载体;该载体为寻找脊髓损伤治疗的新靶点奠定了基础。     

人内皮抑素小环载体在真核细胞中的生物活性

目的通过对人内皮抑素小环载体在真核细胞中的表达和生物学效应的研究,探讨小环载体作为生物治疗载体的可行性。方法将mc-hES、pcDNA-hES分别转染人肝癌细胞HepG2后,通过ELISA、RT-PCR和Westernblot观察hES表达。MTT法检测其对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖抑制作用。结果 mc-hES和pcDNA-hES均能表达hES,mc-hES能明显抑制HUVEC的生长,而对HepG2无明显作用（P〈0.05）。在相同条件下,小环较常规质粒在体外能快速介导转基因的表达,且较传统质粒高6～8.3倍。结论 mc-hES较普通质粒pcDNA-hES在肝癌细胞中能高效表达转基因,为小环载体进一步研究提供了很好的实验基础。     

重组耻垢分枝杆菌Msmc^2-CFP10-ESAT6的构建

目的构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10-ESAT6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法采用基因拼接（Gene SOEing）法体外扩增结核杆菌1hp-ESAT6融合基因,插入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pB-CG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,电转化耻垢分枝杆菌mc2155,构建耻垢疫苗株Msmc2155-CFP10-ESAT6,热诱导表达CFP10-ESAT6融合蛋白,Western blot分析其免疫原性。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,并在耻垢分枝杆菌中经热诱导表达出分子质量单位约为22 ku的CFP10-ESAT6蛋白,该蛋白可被结核病患者血清、鼠抗ESAT6血清和鼠抗CFP10血清识别。结论结核分枝杆菌lhp-ESAT6融合基因在耻垢分枝杆菌中成功表达。