绿色荧光蛋白基因逆转录病毒载体转染人骨髓间充质干细胞及表达的研究

目的　绿色荧光蛋白 (EGFP)基因的逆转录病毒载体转染人骨髓间充质干细胞(MSCs)及其表达情况。方法　pEGFP与逆转录病毒载体经过酶切、连接等构建重组的EGFP 逆转录病毒载体 ,转染PA3 17细胞 ,用G418筛选出抗性克隆 ,获病毒上清 (滴度达到 8.5× 10 5cfu/ml)并感染人MSCs。流式细胞仪测定转染效率后加入成骨细胞分化培养夜 (地塞米松 (10 -7mol/L)、β 甘油磷酸钠 (10mmol/L)、维生素C(5 0mg/L ) ) ,2周后观察转染细胞的分化情况。 结果　 48h后细胞转染效率为 7% ,G418筛选 2周后约 97%细胞出现抗性克隆 ,表达维持 4周。基因转染细胞能够分化为成骨细胞。结论　重组EGFP逆转录病毒载体能转染MSCs ,且不影响细胞的功能。     

人重症肌无力胸腺树突状细胞的分离和培养

目的　探讨人重症肌无力胸腺树突状细胞 (TDC)的分离方法和诱导培养的最佳条件 ,为研究胸腺树突状细胞的生理功能及其在重症肌无力抗原提呈中的作用奠定基础。方法　新鲜人胸腺组织经机械破碎 ,梯度离心获得胸腺低密度细胞 ,经粒 巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)和干细胞因子 (SCF)诱导 ,所获得细胞通过透射电镜、扫描电镜观察 ,并用FITC标记的抗人S10 0b、HLA DR、CD11c抗体进行鉴定。结果　从胸腺组织可获取足够数量胸腺树突状细胞 ,体外培养 10～ 18d细胞生长较为活跃 ,第 14天左右达到最高值 ,维持 3～ 4d开始下降 ,2 0d内细胞数仍能维持在 (1.0～ 2 .5 )× 10 5个 /ml。结论　梯度离心法能成功分离胸腺树突状前体细胞 ,GM CSF和SCF体外诱导可提供胸腺树突状细胞原代培养较为满意的生长条件。     

骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的诱导条件，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分离小鼠骨髓间充质干细胞，在特定肝细胞培养液中用肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)定向诱导。在倒置显微镜下观察细胞形态。应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经HGF和EGF诱导7d后变为肝细胞样圆形；2周后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。结论骨髓间充质干细胞在特定条件诱导下可以向肝细胞方向分化。有可能作为肝组织工程的种子细胞来源。     

过氧化氢对血管平滑肌细胞的作用

目的　研究过氧化氢 (H2 O2 )对兔血管平滑肌细胞的作用机制。方法　兔血管平滑肌细胞 (VSMCs)原代培养 ,微量细胞培养四甲基偶氮唑蓝法 (MTT)检测不同浓度H2 O2 在不同时段对其增殖影响 ,确定进一步研究的H2 O2 浓度 ,并应用流式细胞仪检测此浓度H2 O2 对VSMCs细胞周期和细胞凋亡的作用。结果　MTT法检测 ,H2 O2 浓度≥ 10 0 μmol/L(10 0～ 14 0 0 μmol/L)时 ,与VSMCs作用仅 1h ,即出现吸光度值显著降低 (P <0 .0 1) ;流式细胞仪细胞周期检测 ,H2 O2 浓度≥ 10 0 μmol/L时 ,与VSMCs作用 2 4h后 ,其G1期细胞数显著高于对照组 (94.65 %和 79.97% ) (P <0 .0 1) ,以H2 O2浓度在 10 0 μmol/L时尤为明显 ;流式细胞仪AnnexinV PI双标细胞凋亡检测 ,10 0 μmol/LH2 O2 有促进VSMCs凋亡作用 ,并在作用 48h左右达到高峰 ,占 2 6.76% ,与对照组相比 ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论　H2 O2 浓度≥ 10 0 μmol/L时 ,可显著抑制VSMCs增殖 ;当H2 O2 浓度为 10 0 μmol/L时 ,有促进VSMCs凋亡作用。     

三氧化二砷对人脐静脉内皮细胞中蛋白激酶C活性和白细胞介素-15分泌、表达的影响及其临床意义

目的 通过研究三氧化二砷(As2O3)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中蛋白激酶C(PKC)活性和白细胞介素(IL)-15表达和分泌的影响,探讨内皮细胞在As2O3抑制白血病或肿瘤中的作用。方法用不同浓度的As2O3作用于培养的HUVEC细胞,测定其生长情况、胞膜和胞浆PKC活性以及对IL-15基因表达和分泌的影响。结果0.25 μmol／L~50 μmol／L的.As2O3均抑制HUVEC细胞的增殖(P<0.01),随着药物浓度或作用时间的增加,细胞逐渐死亡。在As2O3作用细胞4 h测定胞浆和胞膜的PKC活性,两者在不同浓度作用下活性水平均得到提升(P<0.01),但胞膜的活性上升幅度更大。在As2O3的测定浓度范围内,PKC的活性水平与As2O3的浓度呈正相关。1、5、16 μmol／L的As2O3导致IL-15基因表达和分泌水平的增加(P<0.01),并呈浓度依赖性关系。结论As2O3可能是通过激活内皮细胞的PKC活性,促进IL-15或其他细胞因子的分泌,来抑制白血病或肿瘤发展的。     

病毒白细胞介素-10转基因在造血干细胞中的表达

目的　观察逆转录病毒转病毒白细胞介素 10 (vIL 10 )基因在体内的表达。方法　用MSCVneo vIL 10重组体在体外转导CBA (H 2 K)小鼠的造血干细胞 (HSCs) ,给经致死照射(90 0rads)的 2 0只同基因CBA(H 2 K)小鼠注入经MSCVneo vIL 10转染的HSCs ,2× 10 6HSCs/只。酶联免疫吸附测定 (ELISA)、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR )、Westernblot分析vIL 10的表达。结果　移植MSCVneo vIL 10转染HSCs的 2 0只小鼠 ,移植后 8周用ELISA检测 ,其中 15只小鼠血清的vIL 10浓度为 :2 70～ 13 40ng/L ,5只小鼠血清的vIL 10为阴性。 12周后有 2只小鼠vIL 10测不出 ,13只小鼠长时间表达vIL 10达 6个月。对照组小鼠血清vIL 10均为阴性。RT PCR和Westernblot证实小鼠的器官均有vIL 10的mRNA和蛋白的表达。结论　逆转录病毒能有效地将vIL 10基因导入造血干细胞并在体内长时间表达。     

脐带间充质干细胞在遗传性痉挛性截瘫中的应用

目的观察脐带间充质干细胞（UC-MSC）治疗遗传性痉挛性截瘫（HSP）的临床疗效及安全性。方法2010年9月及2011年4月,分别给予一HSP家系父子2人行UC-MSC鞘内注射治疗,两个疗程,每次1×106 cells/Kg,每周1次,4次为1个疗程。采用改良的Ashworth肌张力分级标准（MAS）、国际合作共济失调评分量表（ICARS）及日常生活量表（ADL）,对患者治疗前后神经功能、日常生活能力进行评定。结果第一疗程结束1个月与治疗前比较,2人MAS分级、ICARS及ADL评分均降低,两人行走站立稳定性及言语流利程度较治疗前改善;第二疗程结束后1个月与该疗程治疗前比较,2人ICARS及ADL评分降低,儿子肌张力进一步降低,父亲双上肢共济失调减轻。2人治疗后均未见明显不良反应发生。末次治疗结束后随访20个月,父、子俩分别于第二疗程治疗结束7个月及8个月后,症状继续加重。结论 UC-MSC鞘内注射治疗是安全的,可在一定时间内一定程度上减轻患者临床症状,提高患者生活质量,延缓疾病进展,但疗效不能持久。     

脐带间充质干细胞对创伤后早期急性肺损伤作用的研究

目的：探讨脐带间充质干细胞（UCMSC）对创伤后急性肺损伤（ALI）早期的作用.方法：采用撞击后静脉注射脂多糖的二次打击方法复制创伤后ALI家兔模型.24只家兔随机分为正常对照组（正常饲养）、ALI组（复制ALI模型）和UCMSC组（伤前30 min静脉注射UCMSC 1×106个）,每组8只.各组动物于伤后0、1.5、3和6 h测定血浆TNF-α含量;伤后6 h测定PaO2,支气管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α、补体C3a和C5a、白蛋白含量及中性粒细胞计数,肺湿/干重比值（W/D）,免疫组织化学法观察肺组织中TNF-α蛋白的表达,光镜下观察肺组织病理学变化.结果：与正常对照组比较,ALI组PaO2下降,其余各检测指标均明显升高,镜下见肺泡壁破坏,肺泡腔渗出和出血,肺组织TNF-α表达增强.伤前给予UCMSC能提高ALI动物的PaO2,不同程度降低外周血TNF-α及BALF中TNF-α[（0.72±0.70）μg/L比（1.82±0.60）μg/L]、C3a[（0.28±0.07）μg/L比（0.45±0.03）μg/L]、C5a[（0.08±0.01）μg/L比（0.19±0.03）μg/L]、白蛋白含量[（69.0±9.7）mg/L比（102.0±14.9）mg/L]和中性粒细胞计数[（229.0±21.4）×106/L比（298.0±36.8）×106/L],降低肺W/D,抑制肺组织TNF-α蛋白表达,减轻肺泡的损伤程度.结论：UCMSC能减少ALI时组织及血浆TNF-α的含量,减轻肺泡损伤程度,在一定程度上对早期创伤后急性肺损伤起保护作用.     

MK2 plays an important role for the increased vascular permeability that follows thermal injury

We previously reported Rho kinase is involved in vessel hyper-permeability caused by burns. Here we further explore the Rho kinase downstream signaling, it is found that its specific inhibitor Y27632 significantly diminishes the activation of JNK and p38 MAPKs but not ERK that induced by serum from burned rats (burn-serum). JNK activation was found involved in the expression of HUVEC adhesion molecules following thermal injury, although not in the process of stress fiber formation. Inhibition of various MAPKs by specific inhibitors showed that SB203580 (inhibitor of p38), but neither SP600125 (inhibitor of JNK) nor PD98059 (inhibitor of ERK), abolish activation of the p38 downstream kinase MK2. Demonstration of stress fibers by fluorescent-labeled phalloidin showed that inhibition of MK2, either by its specific inhibitor or by dominant negative adeno-viral-carried constructs, significantly reduced burn-serum-induced HUVEC stress-fiber formation, while inhibition of another downstream p38 MAPK kinase, PRAK, had no such effects. Transfection of dominant negative adeno-viral MK2 (Ad-MK2(A)) significantly inhibited thermal injury-induced blood vessel hyper-permeability in rats and, moreover, prolonged the survival of burned rats beyond 72 h following thermal injury. One of the mechanisms behind these phenomena is that Ad-MK2(A) causes a significant depression of burn-serum-induced HSP27-phosphorylation, while the adeno-viral transported dominant negative PRAK (Ad-PRAK(A)) does not block. Although the effect of blockade of MK2 through its adeno-viral approach requires further study and investigation of alternatives to know for sure, we may have found a new pathway behind thermal-injury-induced blood vessel hyper-permeability, namely: Rho kinase > p38 > MK2 > HSP27.     

滋肾通络方对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1、MMP-2、MMP-9mRNA表达影响的实验研究

目的:观察滋肾通络方含药血清对高糖环境下LPS刺激大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)TGF-β1、MMP-2、MMP-9mRNA的影响,并探讨其在防治糖尿病肾病(DN)中的机制。方法:以高糖环境下LPS刺激大鼠肾小球系膜细胞生长建立模型,分为以下8组:(1)正常组;(2)高糖组;(3)高糖+LPS组;(4)苯那普利组;(5)滋肾通络方小剂量组;(6)滋肾通络方中剂量组;(7)滋肾通络方大剂量组。采用RT-PCR技术从分子生物学水平检测各组系膜细胞中TGF-β1、MMP-2及MMP-9mRNA表达。结果:与正常组相比,高糖组、高糖+LPS组TGF-β1mRNA的表达明显升高(P<0.01),MMP-2及MMP-9mRNA的表达明显降低(P<0.01);与模型组相比较,滋肾通络方大、中、小剂量组对大鼠肾小球GMCs TGF-β1mRNA表达显著降低(P<0.05),MMP-2、MMP-9mRNA表达明显升高(P<0.05)。结论:滋肾通络方含药血清能够抑制大鼠肾小球GMCs TGF-β1mRNA的表达,增加MMP-2、MMP-9mRNA的表达,从而通过增加肾小球系膜细胞细胞外基质的降解以延缓DN进展。