树鼩IL-2TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立检测树鼩IL-2基因TaqMan探针实时荧光定量PCR方法.方法 以经ConA诱导培养的树鼩淋巴细胞总RNA为材料,设计特异性引物,通过RT-PCR技术克隆出树鼩IL-2基因,以构建的树鼩IL-2基因质粒为标准品,建立标准曲线,并进行灵敏度检测.结果 建立了树鼩IL-2基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,此法检测灵敏度高,线性范围可达102～109拷贝/ul.结论 成功建立了树鼩IL-2实时荧光定量PCR方法,此方法灵敏度高、特异性强,检测周期短,为探讨IL-2作用的分子作用机制奠定基础.     

香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR的建立与应用

目的建立快速、灵敏、特异的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR体系,用于食源性致病菌监测和淡水鱼产品贸易往来的快速检测。方法根据GenBank公布的香港海鸥形菌16SrRNA基因高保守序列,设计特异引物对和TaqMan-MGB探针,建立和优化快速检测体系,评价反应体系的特异性、灵敏度、重复性,并在淡水鱼类、急性胃肠炎腹泻患者标本中临床应用,结合细菌分离方法和序列测定分析进行验证。结果建立的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应体系检测时限短,仅40min就可出结果,特异性好,与沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌等非目标菌无交叉反应,灵敏度高,检测下限达10拷贝／反应,稳定性好,同一浓度阳性质粒进行16次重复检测的Ct值变异系数0．183％。92份淡水鱼及211份医院急性胃肠炎腹泻标本实时荧光PCR与常规细菌分离结果完全一致,均检出了12株香港海鸥形菌。16SrRNA测序结果显示与HKU1株同源性在99．5％以上,进一步验证了实时荧光PCR的特异性。结论本研究建立的香港海鸥形菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR反应体系快速、特异、灵敏,在防止食源性疾病的传播和加快贸易通关速度方面,具有较强的的应用价值。     

改良分子信标-实时PCR快速检测霍乱弧菌

目的：建立改良分子信标-实时PCR检测霍乱弧菌的快速方法，应用于霍乱监测。方法：根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)的保守序列，设计一对引物和改良分子信标探针，并进行特异性和灵敏度分析；同时以11种细菌作对照，建立改良分子信标检测霍乱弧菌的实时PCR反应体系，应用于霍乱监测。结果：霍乱弧菌改良分子信标检测体系检测12种细菌，只有霍乱弧菌有荧光信号，与其他细菌无交叉反应，DNA灵敏度为102．4fg／ul，菌液灵敏度为32cfu／ml或3cfu／PCR反应体系。对100份海产品和30份腹泻病人大便标本进行检测，结果都为阴性。检测时间仅需2h。结论:改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强，可用于霍乱的快速诊断，为霍乱的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

Genotyping of β-Globin Gene Mutations in Single Lymphocytes: A Preliminary Study for Preimplantation Genetic Diagnosis of Monogenic Disorders

Hemoglobinopathies, especially β-thalassemia (β-thal), represent an important health burden in Mediterranean countries like Turkey. Some couples prefer the option of preimplantation genetic diagnosis (PGD). However, clinical application of PGD, especially for the monogenic disorders is technically demanding. To ensure reliable results, protocols need to be robust and well standardized. Ideally PGD-PCR (polymerase chain reaction) protocols should be based on multiplex and fluorescent PCR for analysis of the disease-causing mutation(s) along with linked markers across the disease-associated locus. In this study, we aimed to constitute a protocol in single cells involving first round multiplex PCR with primers to amplify the region of the β-globin gene containing the most common mutations. Two microsatellites linked to the β-globin gene cluster (D11S4891, D11S2362) and two unlinked (D13S314, GABRB3) microsatellite markers, were used to rule out allele dropout (ADO) and contamination; followed by nested real-time PCR for genotyping the β-globin mutations. We also investigated the allele frequencies and heterozygote rates of these microsatellites in the Turkish population that have not been reported to date. This protocol was tested in 100 single lymphocytes from heterozygotes with known β-globin mutations. Amplification failure was detected in one lymphocyte (1%) and ADO was observed in two lymphocytes (2%). No contamination was detected. All results were concordant with the genotypes of the patients. Overall, this protocol was demonstrated to be sensitive, accurate, reliable and rapid for the detection of β-globin mutations in single cells and shows potential for the clinical application of PGD for hemoglobinopathies in the Turkish population.     

实时三维超声心动图在先天性心脏病诊断中的研究进展

近几年实时三维超声心动图是超声领域的一项新技术,对先天性心脏病的诊断有其特有优势.本文介绍了实时三维超声心动图的发展概况及技术原理,着重综述其在先天性心脏病诊断中的应用.     

一步法Real-time RT-PCR检测结直肠癌前哨淋巴结CK20 mRNA的表达

目的 探讨结直肠癌前哨淋巴结定位和检测CK20 mRNA的意义.方法 对49例结直肠癌患者术中注射美蓝定位前哨淋巴结,用一步法Real-time RT-PCR检测前哨淋巴结CK20 mRNA表达以确定转移病灶.结果 49例结直肠癌患者中成功确定了前哨淋巴结47例,共115枚,每例1～5枚,平均2.4枚/例,检出成功率为95.92％.47例患者前哨淋巴结中,常规病理学证实有11例为肿瘤细胞所浸润,阳性检出率为23.40％;一步法Real-time RT-PCR检测有20例CK20呈阳性表达,阳性检出率为42.55％.两种方法的阳性检出率有显著差异（P＜0.05）.结论 利用一步法Real-time RT-PcR技术检测CK20 mRNA表达可明显提高结直肠癌前哨淋巴结转移病灶的检出率.     

左室收缩同步性的实时三维超声心动图定量评价

目的探讨实时三维超声心动图评价心力衰竭患者左室收缩同步性的临床价值。方法常规二维及实时三维经胸超声心动图检查18例临床诊断心力衰竭患者及20例正常对照组。应用彩色多普勒超声诊断仪PhilipsiE-33配置的Qlab定量分析软件得出左室整体与节段容积-时间曲线并进行分析,参数包括左室舒张末容积(EDV)、收缩末容积(ESV)、左室射血分数(LVEF)、左室最大射血速率(PER)、左室最大充盈速率(PFR),左室16、12、6节段达最低收缩末容量时间(Tmsv)的标准差(Tmsv16-SD、Tmsv12-SD、Tmsv6-SD)、左室161、2、6节段达最低收缩末容量时间的最大差异(Tmsv16-Dif、Tmsv12-Dif、Tmsv6-Dif)。为了便于同一病人治疗前后或不同病人之间进行对比,Qlab分析系统将所测的绝对值自动进行标准化(即标准差及最大差异与一个心动周期的比值[Tmsv16-SD/R-R(%)T、msv12-SD/R-R(%)T、msv6-SD/R-R(%)、Tmsv16-Dif/R-R(%)T、msv12-Dif/R-R(%)、Tmsv6-Dif/R-R(%)]。结果心力衰竭组的LVEF较正常对照组减低,EDV、ESV值大于正常对照组(P<0.05),PER、PFR、Tmsv16-SD、Tmsv12-SD、Tmsv6-SD、Tmsv16-Dif、Tmsv12-Dif、Tmsv6-Dif、Tmsv16-SD/R-R(%)、Tmsv12-SD/R-R(%)、Tmsv6-SD/R-R(%)、Tmsv16-Dif/R-R(%)、Tmsv12-Dif/R-R(%)、Tmsv6-Dif/R-R(%)均明显大于正常对照组(均P<0.01)。结论实时三维超声心动图的左室容积-时间曲线参数,能全面显示心室容积、室壁运动及功能动态变化,为心力衰竭患者的诊断、CRT治疗及预后评估提供更完整的定量信息,Tmsv16-SD、Tmsv12-SD、Tmsv6-SD、Tmsv16-Dif、Tmsv12-Dif、Tmsv6-Dif可作为定量评价左室收缩运动同步性的有效指标。     

实时三平面超声心动图测量左室室壁瘤的左室容积的实验研究

目的探讨实时三平面超声心动图(RT-3PE)测量离体猪心室壁瘤心模型的左室容积,分析此方法的可行性与准确性。方法应用10%福尔马林液固定17个模拟室壁瘤形成的离体猪心,将其浸入水槽中,用二维超声心动图的双平面Simpson法RT-3PE测量左室容积,其值分别与左室注水的真实容积进行对比研究。结果线性回归分析表明实时三平面成像所测左室容积与其真实容积相关性较好(r=0.92,P<0.01);方差分析表明两者间差异无统计学意义(P>0.05)。二维超声心动图双平面Simpson法所测左室容积与真实容积亦具有良好的相关性(r=0.82,P<0.01),但两者间有显著性差异(P<0.05)。Altman and Bland一致性分析显示RT-3PE所测容积与实测容积之间的一致性明显高于二维超声心动图。结论RT-3PE是一快速、准确测量左室室壁瘤左室容积的新方法。