淋病菌流行株耐药与耐药与耐药质粒谱的研究

目的 了解淋球菌流行株的耐药状况,并对耐药表型及质粒谱进行分型。方法 1998－1999年从广东省湛江地区分离出98株淋球菌流行株, 采用琼脂稀释法测定淋球菌对青霉素、四环素及环丙沙星的敏感性;应用碘量法测定β－内酰胺酶,并对耐药表型进行分型;应用碱裂解法提取相应菌株的质粒,对质粒谱进行分型。结果 淋球菌流行株对青霉素、四环素及环丙沙星的耐药率分别为22．44％、45．94％和55．12％;β－内酰胺酶阳性淋球菌占6．12％（6／98）;耐药表型以Susceptible^PT、CMRNG^T、CMRNG^PT、TRNG四型为主,分别占43．86％、23．46％、10．20％和10．20％;98株淋球菌流行株,质粒总检出率为91．84％,42．5kb、39．5kb、7．4kb、4．2kb质粒分别占11．22、41．82％、59．16％和67．32％;质粒谱型12型,以7．4kb 4.2kb、39.5kb 7.4kb 4.2kb为主,分别占21．42％和17．34％。结论 湛江地区淋球菌流行株对环丙沙星的耐药率较高,耐药表型和质粒谱型各有其分布特点。     

显性失活IκBα质粒对胰腺癌PC-3细胞株核因子-κB和环氧合酶-2表达的影响

目的：观察显性失活IκBα质粒转染胰腺癌PC-3细胞株后，对细胞核因子-κB（NF-κB）和环氧合酶-2（COX-2）表达的影响。 方法： 免疫组织化学证实NF-κB和COX-2在胰腺癌PC-3细胞株中的表达，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blotting）检测PC-3细胞转染显性失活IκBα质粒后，细胞中NF-κB和COX-2表达的变化。 结果： 胰腺癌PC-3细胞株中存在NF-κB和COX-2的表达，转染显性失活IκBα质粒后，细胞中NF-κB和COX-2表达均下调，且体现出一定的时间依赖性关系。 结论： 胰腺癌PC-3细胞株中存在NF-κB和COX-2的阳性表达。显性失活的IκBα质粒可抑制细胞中NF-κB和COX-2的表达。     

肝内表达的外源性肝细胞生长因子抑制肝细胞凋亡的机制

目的 通过体内基因转染方法在肝细胞中建立持续、高效表达外源性肝细胞生长因子(HGF)的体系,探讨其在肝细胞凋亡中的作用.方法 通过尾部静脉快速注射大量pCMV-HGF质粒,ELISA检测外周血和肝组织中HGF表达的高峰和持续时间.实验动物分为模型组、pcDNA3空质粒保护组、pCMV-HGF质粒保护组和0.9%氯化钠溶液对照组,每组10只,Western印迹检测Caspase-3,tBid、Bax、细胞色素C的表达.所有数据组间均数比较采用单因素方差分析,均数间的两两比较用q检验.结果 在小鼠尾静脉快速大量注射pCMV-HGF 4 h后就有外源性HGF表达,外周血和肝组织中分别于12 h和8 h达高峰,于注射后第6天仍可检测到HGF表达.D-氨基半乳糖胺/脂多糖可诱导明显的细胞凋亡,并导致tBid、Bax、Caspase-3及细胞色素C的表达明显增加.与模型组和pcDNA3空质粒保护组相比,pCMV-HGF保护组tBid、Bax、Caspase-3及细胞色素C的表达明显减少.结论 外源性HGF能抑制小鼠肝细胞凋亡,通过抑制Bid的活性片段tBid的表达,减少下游凋亡蛋白的激活.     

质粒介导的血管抑制和免疫强化协同诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的 探讨真核表达质粒介导的血管抑制和免疫强化治疗诱导小鼠种植性肝癌肿瘤细胞凋亡的效果和机制.方法 制备、纯化小鼠内皮抑制素真核表达质粒(pSecES)和小鼠白细胞介素12(IL-12)质粒(pmlL-12).小鼠股部肌肉内接种H22细胞建立肝癌种植瘤模型,分成4组,接种部位分别多次注射pSecES、pmIL-12、pSecES+pmlL-12和pcDNA3.1质粒裸DNA,观察种植瘤的形成和重量;肿瘤组织切片CD31免疫组织化学染色检测肿瘤微血管密度,HE染色观察肿瘤浸润淋巴细胞,并用TUNEL检测肿瘤细胞的凋亡.结果 与pcDNA3.1对照组相比,注射pSecES,pmIL-12组小鼠肝癌种植瘤生长缓慢,血管减少,后者并可见瘤内大量淋巴细胞浸润.两组肿瘤细胞凋亡增加,pSecES、pmIL-12和pcDNA3.1组凋亡细胞数分别为(11.3±4.1)、(14.6±3.2),(1.4±1.3)个/高倍视野,pSecES+pmIL-12组凋亡细胞数为(19.9±5.5)个/高倍视野,明显高于单一治疗组.结论 真核表达质粒介导的血管抑制和免疫强化治疗可通过抑制肿瘤血管形成,促进瘤内淋巴细胞浸润,协同诱导肿瘤细胞凋亡,较好的抑制了小鼠种植性肝癌的生长.     

两种克隆方法在3种截短的泡球蚴Em18原核表达载体构建中的比较

目的比较3种截短的泡球蚴Em18基因聚合酶链反应(PCR)扩增产物经TA克隆和直接酶切2种方法,在原核表达质粒构建中的运用。方法PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的3种截短的泡球蚴Em18基因,经2种方法构建3种截短的Em18原核表达质粒：①PCR扩增产物与T载体连接构建T-Em18,重组质粒经EcoRⅠ/XhoⅠ酶切,电泳分离、纯化目的片段,再与经过EcoRⅠ/XhoⅠ酶切的原核表达载体pET41a( )连接；②PCR扩增产物经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切,电泳、纯化,直接与经过相同限制性内切酶酶切的pET41a( )连接。结果先经TA克隆,再经酶切构建3种截短的泡球蚴Em18原核表达载体获得成功。而采用直接酶切PCR扩增产物的构建方法未获得成功。结论TA克隆可用于对直接酶切效果不好的PCR扩增片段与表达载体的连接构建,方法简便高效,可提高带有限制性酶切位点的PCR扩增片段克隆人原核表达载体的效率。     

肝细胞生长因子与肝再生增强因子重组表达质粒对大鼠肝纤维化的影响

目的 研究肝细胞生长因子(HGF)与肝再生增强因子(ALR)重组表达质粒对大鼠实验性肝纤维化的治疗作用.方法 建立二甲基亚硝胺肝纤维化模型后的90只S-D大鼠分为空白组、pcDNA3.1治疗组、pcDNA3.1-HGF治疗组、pcDNA3.1-ALR治疗组、pcDNA3.1-HGF与pcDNA3.1-ALR共治疗组、pcDNA3.1-HGF-ALR治疗组,每组15只.各治疗组大鼠每24小时经尾静脉注射1次相应质粒0.1 μmol,连续3次,空白组不接受任何治疗,另取同批次S-D大鼠10只作为对照组.治疗结束后4 d处死大鼠,留取肝组织采用HE染色观察肝脏的病理形态,采用免疫组织化学染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)和c-jun的表达.计量资料采用单因素方差分析,两两比较采用SNK检验,计数资料采用Fisher确切概率法分析.结果 空白组和pcDNA3.1治疗组大鼠肝组织有明显的条索状纤维间隔形成,可见假小叶,两组肝纤维化程度差异无统计学意义(x2=0.317,P=1. 000);其他治疗组肝纤维化均有不同程度改善,以pcDNA3.1-HGF-ALR治疗组改善最明显.对照组肝组织PCNA和c-jun表达均较低,其吸光度值分别为8.6±1.9和3.2±1.2;空白组与pcDNA3.1治疗组肝组织PCNA和c-jun表达均增加,其吸光度值分别为24.1±3.0.24.5±4.3与23.8±3.1、24.9±4.2,与对照组比较,差异有统计学意义(均P＜0.01);其他治疗组的PCNA表达显著增加,c-jun表达显著降低,均以pcDNA3.1-HGF-ALR治疗组的变化最明显.结论 重组表达质粒pcDNA3.1-HGF-ALR能较好地改善大鼠实验性肝纤维化,并可能通过促进肝细胞增殖和抑制原癌基因c-jun的表达来发挥其抗肝纤维化作用.     

源自同一患者的二株血和粪便对碳青霉烯类耐药大肠埃希菌

目的 了解对碳青霉烯类抗菌药物耐药大肠埃希菌的耐药机制及与内源性感染的关系.方法 将临床分离的来源于同一患者血培养和粪便培养的大肠埃希菌2株,采用浓度梯度法(E-test)测定亚胺培南、美罗培南的最低抑菌浓度(MIC)值,纸片扩散法测定其他16种抗菌药物的敏感性,等电聚焦电泳(IEF)检测所产生的β-内酰胺酶,PCR及序列分析确定其基因型,接合试验和Southern杂交进行耐药基因定位,脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析2株菌株的同源性.结果 亚胺培南、美罗培南对2株大肠埃希菌的MIC值均≥32 mg/L,均产KPC-2(等电点值为6.7)和SHV-12(等电点值为8.2).blaKPC-2基因位于可转移的54 kb质粒上.PFGE显示2株大肠埃希菌为同一克隆株.结论 2株大肠埃希菌的耐药性及染色体DNA酶切图谱均一致,该患者大肠埃希菌败血症极可能是肠道的大肠埃希菌移位引起的内源性感染.     

肺炎克雷伯菌中质粒介导的AmpC酶及相关表型研究

目的 证实临床分离的部分肺炎克雷伯菌（Kp）除产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）外，还同时产AmpC酶，并探讨了AmpC酶编码基因存在方式。方法 对临床分离的可疑同时产ESBLs和其他高活性广谱β内酰胺酶的8株Kp进行接合试验，并对供体菌和接合子同时采用三维试验、ESBLs试验、AmpC酶诱导试验和β内酰胺类抗生素最低抑菌浓度（MIC）试验测定，并进行AmpC基因携带状态、表达方式和酶活性分析。结果 8株Kp菌通过接合试验共得到10株接合子，其中有6株供体菌均只得到同时表达AmpC和ESBLs的1种接合子；另2株供体菌，各得2株接合子，1株同时表达AmpC和ESBLs，1株仅表达ESBLs；8株供体菌均未得到单独表达AmpC的接合子。表达AmpC接合子的耐药表型与受体菌非常接近，酶的活性也必须用克拉维酸（CA）和邻氯西林（CLO）两种酶抑制剂才能完全抑制，其中有5株可被头孢西丁（FOX）诱导使某些指示药出现截平现象。结论 在Kp中，已出现质粒携带的AmpC基因，有可能与编码ESBLs的基因存在于同一质粒上，并具有诱导型和非诱导型两种表达形式。     

淋病流行株耐药性及耐药基因的定位分析

目的 了解淋病流行株的耐药性，并对其耐药基因进行定位分析。方法 2000～2001年从广东省湛江地区分离到98株淋病流行株，采用K-B法测定淋球菌对10种抗生素的敏感性，应用碱裂解法提取相应菌株的质粒，选择NG4、NG31、NG43、NG70菌株作质粒的接合及消除试验，对耐药基因进行定位。结果 98株淋病流行株对环丙沙星、四环素、氯霉素耐药率分别为82．65％、69．39％、50．00％；质粒总检出率为91．84％，42．5kb、39．5kb、7．4kb、4．2kb质粒分别占11.22％、41.82％、59．16％、67．32％。NG31、NG43能通过接合将对四环素和氯霉素的耐药性传递给受体菌，而通过质粒消除又可恢复对抗生素的敏感性；环丙沙星的耐药性通过接合及消除未见改变。结论 湛江地区淋病流行株耐药形势严峻，耐药基因定位显示，淋球菌对四环素和氯霉素的耐药由质粒介导，对环丙沙星的耐药则由染色体介导。     

心肌特异性hVEGF165真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建MLC-2v启动子驱动的真核表达载体并鉴定特异性。方法：用MLC-2v启动子基因片段替代质粒pIRES2-EGFP的CMV启动子，而保留其增强子序列，并将目的基因hVEGF165分别克隆到两种启动子驱动的质粒，构建MEG-2v／pIRES2-EGFP-hVEGF165和pIRES2-EGFP-hVEGF165 2种质粒，瞬时转染心肌、内皮、平滑肌和成纤维细胞。结果：转染pIRES2-EGFP-hVEGF165，4种细胞均表达、目的基因及产物；而转染MLC-2v／plRES2-EGFP-hvEGF165，仅心肌细胞表达GFP和目的基因产物。结论：MLC-2v启动子驱动的质粒可心肌特异表达目的基因及蛋白。