淋病流行株耐药性及耐药基因的定位分析

目的 了解淋病流行株的耐药性，并对其耐药基因进行定位分析。方法 2000～2001年从广东省湛江地区分离到98株淋病流行株，采用K-B法测定淋球菌对10种抗生素的敏感性，应用碱裂解法提取相应菌株的质粒，选择NG4、NG31、NG43、NG70菌株作质粒的接合及消除试验，对耐药基因进行定位。结果 98株淋病流行株对环丙沙星、四环素、氯霉素耐药率分别为82．65％、69．39％、50．00％；质粒总检出率为91．84％，42．5kb、39．5kb、7．4kb、4．2kb质粒分别占11.22％、41.82％、59．16％、67．32％。NG31、NG43能通过接合将对四环素和氯霉素的耐药性传递给受体菌，而通过质粒消除又可恢复对抗生素的敏感性；环丙沙星的耐药性通过接合及消除未见改变。结论 湛江地区淋病流行株耐药形势严峻，耐药基因定位显示，淋球菌对四环素和氯霉素的耐药由质粒介导，对环丙沙星的耐药则由染色体介导。     

肝内表达的外源性肝细胞生长因子抑制肝细胞凋亡的机制

目的 通过体内基因转染方法在肝细胞中建立持续、高效表达外源性肝细胞生长因子(HGF)的体系,探讨其在肝细胞凋亡中的作用.方法 通过尾部静脉快速注射大量pCMV-HGF质粒,ELISA检测外周血和肝组织中HGF表达的高峰和持续时间.实验动物分为模型组、pcDNA3空质粒保护组、pCMV-HGF质粒保护组和0.9%氯化钠溶液对照组,每组10只,Western印迹检测Caspase-3,tBid、Bax、细胞色素C的表达.所有数据组间均数比较采用单因素方差分析,均数间的两两比较用q检验.结果 在小鼠尾静脉快速大量注射pCMV-HGF 4 h后就有外源性HGF表达,外周血和肝组织中分别于12 h和8 h达高峰,于注射后第6天仍可检测到HGF表达.D-氨基半乳糖胺/脂多糖可诱导明显的细胞凋亡,并导致tBid、Bax、Caspase-3及细胞色素C的表达明显增加.与模型组和pcDNA3空质粒保护组相比,pCMV-HGF保护组tBid、Bax、Caspase-3及细胞色素C的表达明显减少.结论 外源性HGF能抑制小鼠肝细胞凋亡,通过抑制Bid的活性片段tBid的表达,减少下游凋亡蛋白的激活.     

肝细胞生长因子与肝再生增强因子重组表达质粒对大鼠肝纤维化的影响

目的 研究肝细胞生长因子(HGF)与肝再生增强因子(ALR)重组表达质粒对大鼠实验性肝纤维化的治疗作用.方法 建立二甲基亚硝胺肝纤维化模型后的90只S-D大鼠分为空白组、pcDNA3.1治疗组、pcDNA3.1-HGF治疗组、pcDNA3.1-ALR治疗组、pcDNA3.1-HGF与pcDNA3.1-ALR共治疗组、pcDNA3.1-HGF-ALR治疗组,每组15只.各治疗组大鼠每24小时经尾静脉注射1次相应质粒0.1 μmol,连续3次,空白组不接受任何治疗,另取同批次S-D大鼠10只作为对照组.治疗结束后4 d处死大鼠,留取肝组织采用HE染色观察肝脏的病理形态,采用免疫组织化学染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)和c-jun的表达.计量资料采用单因素方差分析,两两比较采用SNK检验,计数资料采用Fisher确切概率法分析.结果 空白组和pcDNA3.1治疗组大鼠肝组织有明显的条索状纤维间隔形成,可见假小叶,两组肝纤维化程度差异无统计学意义(x2=0.317,P=1. 000);其他治疗组肝纤维化均有不同程度改善,以pcDNA3.1-HGF-ALR治疗组改善最明显.对照组肝组织PCNA和c-jun表达均较低,其吸光度值分别为8.6±1.9和3.2±1.2;空白组与pcDNA3.1治疗组肝组织PCNA和c-jun表达均增加,其吸光度值分别为24.1±3.0.24.5±4.3与23.8±3.1、24.9±4.2,与对照组比较,差异有统计学意义(均P＜0.01);其他治疗组的PCNA表达显著增加,c-jun表达显著降低,均以pcDNA3.1-HGF-ALR治疗组的变化最明显.结论 重组表达质粒pcDNA3.1-HGF-ALR能较好地改善大鼠实验性肝纤维化,并可能通过促进肝细胞增殖和抑制原癌基因c-jun的表达来发挥其抗肝纤维化作用.     

载ACEshRNA表达质粒壳聚糖纳米转染培养的大鼠血管内皮细胞实验性研究

目的研究载血管紧张素转化酶短发卡RNA(ACEshRNA)表达质粒壳聚糖纳米颗粒对体外培养大鼠血管内皮细胞的转染效率。方法采用离子交联法制备壳聚糖纳米粒,喷金扫描电子显微镜鉴定;通过静电吸附复合ACEshRNA表达质粒,采用琼脂糖凝胶电泳分析载体与DNA结合能力;用体外培养大鼠血管内皮细胞转染实验,评价体外壳聚糖颗粒的转染能力。结果体外对培养的大鼠血管内皮细胞的转染实验显示,绿色荧光蛋白的表达,说明该壳聚糖有一定的转染效率,且在壳聚糖与质粒体积比为1∶3时转染率最高。结论本研究制备的载ACEshRNA表达质粒壳聚糖纳米载体,能在体外培养的大鼠血管内皮细胞实现有效转染,并且为进一步转染条件的优化奠定实验基础。     

中介素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建带有绿色荧光蛋白的中介素(IMD)真核表达质粒pIRES2-EGFP/IMD,并转染大鼠近端肾小管上皮细胞系(NRK-52E)。方法合成带有IMD基因片段的pMD19-TSimple/IMD质粒,将pMD19-TSimple/IMD质粒和pIRES2-EGFP载体双酶切之后进行高效连接,将IMD亚克隆至pIRES2-EGFP上,对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用FuGENEHD转染试剂转染NRK-52E细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白。提取细胞mRNA和蛋白,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测基因表达,Western检测IMD蛋白表达。结果经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/IMD载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的NRK-52E细胞有绿色荧光蛋白的表达,经RT-PCR和Western测定分析,转染细胞IMD基因及蛋白的表达增加。结论pIRES2-EGFP/IMD载体构建成功,并在NRK-52E细胞内成功表达。     

人白细胞介素-24治疗人宫颈癌荷瘤裸鼠的实验研究

目的探讨人白细胞介素(hIL)-24基因重组质粒对人宫颈癌Siha细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其作用机制。方法建立荷宫颈癌Siha细胞裸鼠移植瘤模型,15只裸鼠随机分为3组:白细胞介素(IL)-24重组质粒组,空质粒组,磷酸盐缓冲液(PBS)组,根据肿瘤体积的生长情况绘制肿瘤生长曲线;处死裸鼠后切取瘤体并称质量,计算肿瘤抑制率;用流式细胞仪检测细胞周期。结果体内实验表明,IL-24重组质粒能够抑制肿瘤的生长,IL-24重组质粒组移植瘤的体积明显小于空质粒组和PBS组(P<0.05),空质粒组和PBS组移植瘤体积则差异无统计学意义(P>0.05)。IL-24重组质粒组抑瘤效果显著,其抑瘤率为56.5%,差异有统计学意义(P<0.05),空质粒组抑瘤率为1.3%,差异无统计学意义(P>0.05)。经流式细胞术检测,与空质粒组和PBS组比较,IL-24重组质粒组G0/G1期细胞增多(P<0.05),S期细胞减少,G2/M期细胞减少(P<0.05),细胞被阻滞在G0/G1期,空质粒组和PBS组则差异无统计学意义(P>0.05)。结论于荷瘤裸鼠的瘤内注射IL-24重组质粒可抑制肿瘤生长,提示IL-24具有明显的体内抗肿瘤作用。     

烧伤病房鲍氏不动杆菌质粒介导的16S rRNA甲基化酶基因及耐药性传递研究

目的 调查烧伤病房鲍氏不动杆菌临床分离株的耐药性,了解是否存在介导高水平氨基糖苷类抗菌药物耐药的16S rRNA甲基化酶基因,探讨传播机制.方法 收集2006年5月-2007年12月从甘肃省人民医院烧伤病房分离的40株鲍氏不动杆菌.采用纸片扩散法测定其对20种抗菌药物的敏感性;琼脂稀释法测定其对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、异帕米星和卡那霉素6种氨基糖苷类抗菌药物MIC;PCR扩增5种甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD;阳性PER产物纯化测序;碱裂解法提取质粒;接合实验及质粒转化实验确定耐药性传递方式.结果 40株鲍氏不动杆菌对6种氨基糖苷类抗菌药物的耐药率分别为72.5%、72.5%、70.0%、67.5%、70.0%、70.0%;对6种氨基糖苷类抗菌药物全部耐药的菌株有25株占62.5%,其中armA基因阳性10株占40.0%,未检出rmtA、rmtB、rmtC、rmtD阳性菌株.10株转化子、10株接合子对氨基糖苷类抗菌药物均高度耐药,MIC≥256 μg/mL者全部携带armA基因.结论 烧伤病房鲍氏不动杆菌临床分离株耐药率极高,从中检出16S rRNA甲基化酶基因armA且位于质粒染色体上.     

表达HIV-1 B亚型env基因的质粒DNA及腺病毒载体疫苗的免疫原性研究

目的 构建表达中国B亚型HIV-1流行株env基因的DNA及重组腺病毒载体疫苗,将其用于预防或治疗HIV感染.方法 构建质粒DNA疫苗pVR-gp160及重组腺病毒载体疫苗rAdV-gp160.将这两种疫苗以不同的方式免疫BALB/c小鼠,分别采用ELISPOT方法 和ELISA方法 检测免疫小鼠中HIV-1 Gp120特异性细胞免疫反应及抗体反应.结果 DNA疫苗单独免疫及DNA疫苗初免/腺病毒疫苗加强免疫的联合免疫方案皆可诱导较高水平的Gp120特异性细胞免疫反应;而在体液免疫方面,各实验组产生的Gp120特异性抗体水平都较低.结论 所构建的DNA疫苗及rAdV疫苗能有效表达Gp160蛋白,并可有效激活机体的细胞免疫反应.     

大鼠细胞因子信号转导抑制因子-1基因的原核克隆表达和免疫学分析

目的 克隆表达大鼠细胞因子信号转导抑制因子-1基因(SOCS-1).方法 将大鼠SOCS-1全长编码基因的PCR产物,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-ratSOCS-1.转化大肠埃希菌BL-21/DE3,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用镍离子金属螯合剂亲和层析柱从表达产物中纯化重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对表达产物和重组蛋白进行鉴定.应用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,抗体滴度达到1:10000以上后进行末次免疫,2周后心脏取血、测定滴度,分离制备免疫血清.用红细胞裂解法制备大鼠外周血白细胞裂解全蛋白.将阴性血清(未用重组蛋白免疫的新西兰大白兔的血清)、免疫血清及兔抗组氨酸标签抗体转入各蛋白条带,用Western免疫印迹检测重组蛋白的免疫学活性.结果 PCR、双酶切及DNA测序分析均表明重组质粒pET-28a(+)-ratSOCS-1构建成功.SDS-PAGE结果可见转化了重组质粒的大肠埃希菌全菌和经超声裂解后的菌体沉淀的样品均在相对分子质量约26 000处有一明显的蛋白条带,经亲和层析获得的纯化重组蛋白有特异的单一条带与上述条带一致,而在超声裂解后的菌体上清中相同位置却未见有蛋白表达条带.Western免疫印迹表明重组蛋白、大鼠外周血白细胞裂解蛋白中相对分子质量约24000的蛋白条带、兔抗组氨酸标签抗体均可被免疫血清识别,分别出现清晰的相对分子质量26000、24 000、26000的反应条带,表明其具有免疫活性.结论 SOCS-1基因可以在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得表达,其纯化重组蛋白具有良好的抗原性和免疫活性.     

棒状杆菌滤膜接合法质粒接合转移实验方法的研究

目的 建立棒状杆菌的滤膜接合法质粒接合转移实验方法 .方法 采用滤膜接合法行质粒接合转移实验.第一次异种属之间的质粒接合转移实验,使用琼脂稀释法筛选出3株高耐红霉素的粪肠球菌临床分离株,红霉素最低抑菌浓度(MIC)>256 mg/L,左氧氟沙星MIC≤8 mg/L,作为供体菌;3株棒状杆菌临床分离株的红霉素MIC≤32 mg/L,左氧氟沙星MIC为128 mg/L,作为受体菌.第二次同属不同种细菌之间的质粒接合转移实验.用第一次转移成功的3株接合子干燥棒状杆菌(红霍素MIC>256 mg/L,头孢他啶MIC为16 mg/L)作为供体,分别向6株不同种的棒状杆菌(红霉索MIC≤32 mg/L,头孢他啶MIC≥128 mg/L)进行质粒接合转移.结果异种属之间的质粒接合转移实验中,3株粪肠球菌作为供体分别向3株棒状杆菌进行9次质粒接合转移,有4株接合子成功转移了耐药表型和基因型,转移频率为44%.同属不同种细菌之间的质粒接合转移实验中,3株转移成功的干燥棒状杆菌作为供体分别向6株不同种的棒状杆菌进行18次质粒接合转移,有7株接合子成功转移了耐药表型,转移频率为39%.接合子不同程度地获得了对红霉素的耐药性,棒状杆菌获得了粪肠球菌的耐药性,并凡将耐药性再传递给了同属不同种的其他棒状杆菌.结论 滤膜接合法质粒接合转移实验可以用于研究棒状杆菌的耐药传递机制.