RNA干扰技术选择性下调大鼠血管紧张素Ⅱ 1a型受体及其作用的实验研究

目的用RNA干扰技术选择性下调大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）上血管紧张素Ⅱ1a（AT1a）型受体的表达,并检验其对细胞活性及增殖的影响。方法构建携带U6启动子和AT1a特异短发夹RNA（shRNA）编码序列的质粒载体pAT1a-shRNA1,pAT1a-shRNA2,以含非特异性shRNA编码序列的质粒载体pGenesil-Con（pCon）为对照,转染原代培养的大鼠主动脉VSMCs,通过半定量RT-PCR和Western blot法检测AT1a、AT2受体的表达情况,以内参照β-肌动蛋白进行标化。用四甲基氮唑盐（MTY）比色法（测A490nm值）检验其对细胞活性及血管紧张素Ⅱ促增殖效应的影响。结果pAT1a-shRNA1使AT1a的mRNA和蛋白质表达分别降低82％和69％,pAT1a-shRNA2使之分别降低77％和56％,差异有统计学意义。转染对照质粒组与空白对照组AT1a受体表达差异无统计学意义;各组AT2受体表达差异无统计学意义。单纯转染质粒各组A490nm差异无统计学意义,给予血管紧张素Ⅱ刺激后,pAT1a-shRNA1、pAT1a-shRNA2组A490nm显著低于空白对照组和对照质粒组。结论RNA干扰技术能选择性下调原代培养的VSMCs AT1a受体的表达,并显著抑制血管紧张素Ⅱ促细胞增殖的效应,无明显细胞毒性。这可能为相关基因的功能研究提供新的方法,亦可能为心血管疾病基因治疗的探索开拓新的思路。     

临床分离黏质沙雷菌染色体及质粒介导的喹诺酮类耐药机制研究

目的 了解安徽地区临床分离株黏质沙雷菌质粒介导喹诺酮类耐药基因的流行情况以及gyrA、parC基因变异对抗菌药物的耐药性产生的影响.方法 采用琼脂稀释法测定2005至2010年34家医院收集的104株黏质沙雷菌的MIC;采用PCR检测其中31株耐环丙沙星的黏质沙雷菌的qnr、aac(6’) -Ib、qepA基因以及gyrA和parC基因,对阳性扩增产物进行测序分析;对qnr、aac(6’) -Ib-cr阳性菌株做转移接合试验,PCR扩增并测序确定接合子的基因型,测定供体菌、受体菌和接合子对喹诺酮类及其他类型抗菌药物的MIC.结果 共检出31株环丙沙星耐药的黏质沙雷菌,共6株携带qnr基因和(或)aac(6’)-Ib-cr基因,其中2株携带qnrB6亚型,1株携带qnrS2亚型,4株携带aac(6’)-Ib-cr基因(其中1株同时携带qnr基因).9株检测出gyrA基因突变,7株检测出parC基因突变.6株携带qnr基因和(或)aac(6’)-Ib-cr基因的菌株中有5株转移接合成功.接合子与受体菌相比,对喹诺酮类的MIC值均有不同程度的提高.结论 染色体及质粒介导的耐药基因在临床分离的黏质沙雷菌对喹诺酮类药物耐药中起重要的作用,且可以水平传播,故应引起高度重视.     

大鼠肝细胞生长因子与肝再生增强因子融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建大鼠肝细胞生长因子(rHGF)与大鼠肝再生增强因子(rALR)融合基因的真核表达质粒并进行鉴定,为新的肝纤维化治疗方法奠定实验基础.方法 分别以重组质粒pUC18-rHGF和pUC18-rALR为模板,进行PCR扩增,获得rHGF和rALR的基因片段;利用重叠延伸PCR方法将获得的基因片段通过一个连接序列(linker)进行连接,构建融合基因rHGF-linker-rALR,将融合基因定向插入pcDNA3.1真核表达质粒的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点之间,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-rHGF-linker-rALR,并进行双酶切及测序鉴定.结果 rHGF和rALR的PCR扩增产物电泳后分别观察到2200 bp和400 bp的条带,与理论值相符.重叠延伸PCR获得的融合基因产物电泳后观察到2600 bp的条带,与预期值一致.重组真核表达质粒pcDNA3.1-rHGF-linker-rALR经双酶切,电泳后观察到2600 bp和5400 bp的两条DNA条带,与预期值相符,测序鉴定结果表明序列正确.结论 成功构建了rHGF与rALR融合基因的真核表达质粒,为肝纤维化的基因治疗奠定了实验基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白通过自诱导方式可溶性表达及其生物学功能鉴定

目的 构建包含HCV核心蛋白全长基因的重组原核表达质粒,经转化表达型大肠杆菌后自诱导培养以获取可溶性重组核心蛋白,并检测其生物学功能. 方法 以H/FL质粒为模板,通过PCR扩增全长HCV核心蛋白DNA.PCR产物经双酶切后定向克隆到pET28a原核表达载体中.将重组的原核表达载体转化表达型大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS,并通过自诱导培养的方式使其在高浓度状态下表达重组核心蛋白.重组核心蛋白经Western blot检测鉴定生物学功能,并与HCV NS3蛋白进行相互结合后共同纯化实验. 结果 重组核心蛋白大量存在于表达菌破菌上清液中.Western blot检测结果显示其具有核心蛋白抗原性.重组核心蛋白不能单独通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,但可以与HCV NS3蛋白结合后共同纯化. 结论 成功表达可溶性的重组核心蛋白,证明了其生物学活性.重组核心蛋白与HCV NS3蛋白存在相互作用.