金黄色葡萄球菌基因敲除质粒的构建及应用

背景：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已经成为全球院内感染的首要致病菌,建立快速简单的基因敲除方法是研究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌毒力、耐药性的重要技术。 目的：构建适用于金黄色葡萄球菌基因敲除的质粒,用于金葡菌耐药性及毒力的研究。 方法：以pUC19为构建的基本骨架,通过overlap PCR的技术手段,把pCL52.1中pLE194Ts温敏复制子及质粒pHY300PLK中四环素抗性基因片段,通过高保证扩增后,连接入pUC19的EcoRⅠ位点,保留pUC19中所有的多克隆位点,构建大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒,并对金黄色葡萄球菌N315 dapB基因进行敲除,通过多重PCR对基因敲除菌株进行鉴定。 结果与结论：成功构建了大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒pYZ1和pYZ8,并用于金葡菌基因的敲除,通过酶切及overlap技术构建了同源重组质粒pYZ-ΔdapB,电转入RN4220进行修饰后,再电转入N315,通过温度筛选,获得了dapB基因突变菌株,成功的敲除了dapB基因。提示pYZ1和pYZ8能够成功用于金黄色葡萄球菌耐药菌株基因的敲除,为进一步研究临床金黄色葡萄球菌分离株耐药性及毒力提供了工具。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

Comparison of CMY-2 plasmids isolated from human,animal, and environmental Escherichia coli and Salmonella spp. from Canada

A total of 244 CMY-2 plasmids from 5 separate studies involving Escherichia coli and Salmonella human clinical cases as well as E. coli from feedlots and water sources were examined. Genetically similar CMY-2 plasmids isolated from either E. coli or Salmonella from human, animal, and environmental sources are widely distributed across Canada and cluster into replicon types I1, A/C, and K/B and an unidentified group.     

全营养液促脂质体介导质粒DNA转染结肠直肠癌细胞的实验研究

目的　探讨全营养液 (TNA)促进脂质体介导质粒DNA转染结直肠癌细胞的作用。方法　采用细胞培养方法 ,利用绿色荧光蛋白基因做报告基因 ,配制不同转染液 :脂质体加pEGFP N1、TNA加脂质体加pEGFP N1、TNA加pEGFP N1、单纯脂质体、单纯TNA ,分别处理人结肠癌细胞LoVo、人直肠癌细胞HR 8348,检测癌细胞中绿色荧光蛋白的表达。　结果　未加pEGFP N1质粒DNA的单纯脂质体和单纯TNA处理的细胞不表达绿色荧光蛋白。TNA加脂质体加pEGFP N1对LoVo、HR 8348细胞的转染效率分别为 33%、38% ;脂质体加pEGFP N1组的转染效率为 2 2 %、2 4% ;TNA加pEGFP N1组的转染效率均为 1%。TNA加脂质体加pEGFP N1组转染效率高于其他转染组 (P <0 0 1)。质粒DNA对TNA溶液的稳定性无显著影响。　结论　TNA可促进脂质体介导质粒DNA转染结直肠癌细胞 ,将营养支持与基因治疗相结合 ,有望提高对肿瘤患者支持治疗效果。     

重组HIF—1α及NIS慢病毒表达载体的构建及功能鉴定

目的构建肌凝蛋白轻链-2（MLC-2v）启动下HIF-1α及人NIS慢病毒真核表达载体,探讨外源基因在心肌细胞中的特异性表达和NIS作为报告基因的可行性。方法应用基因重组技术构建慢病毒（Lv）-延长因子（EF）1-HIF-1α-内部核糖体进入位点（IRES）-NIS及Lv-MLC-HIF-1α-IRES-NIS慢病毒表达载体。对重组质粒进行酶切、测序鉴定后,采用脂质体转染法将重组质粒转入Hela细胞。细胞免疫荧光及Westernb1a分别验证HIF-1α及NIS蛋白在细胞中的定位及定量表达;制备重组病毒,分别以不同的感染复数（MOI）感染H9C2大鼠心肌细胞、NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞和L6大鼠骨骼肌成肌细胞,Westernb1a确定最佳MOI并验证MLC·2v启动子的特异性;分别行H9C2细胞动态摄碘和NaClO4抑制实验。采用两样本t检验分析数据。结果成功构建Lv-EFl-HIF-1a-IRES-NIS及Lv-MLC-HIF-1α-IRES-NIS慢病毒表达载体。2种质粒分别转染Hela细胞,免疫荧光显示HIF-1α蛋白表达于胞质,NIS蛋白表达于胞膜;Westernb1a显示EFl启动下2种蛋白质的表达量多于MLC-2v启动下相应表达。Westernb1a蛋白检测后测定蛋白灰度值,阳性对照组NIS及HIF-1α灰度值分别为69-8和71-9,EF1启动下分别为109-4和92-7,MLC-2v启动下分别为141-9和132-4。Lv-MLC-HIF-1α-IRES-NIS病毒感染H9C2细胞,MOI为20时NIS蛋白表达最高,为最佳MOI。2种病毒以MOI为20分别感染H9C2、NIH-3T3及L6细胞,Westernb1a显示EF1启动下NIS蛋白在3种细胞中均有表达,灰度值分别为23.4、29.8和28.6,相差较小。MLC-2v启动下仅H9C2细胞中有大量NIS蛋白表达,NIS蛋白在H9C2、L6及NIH-3T3细胞的灰度值分别为157.9、178.8和2173。H9C2细胞的摄碘高峰时间为40min,峰值为4287.2计数·min-1,是阴性对照组（254.g计数·min-1）的16.85倍（t=5.34,P〈0.01）。摄碘可被NaC国O4抑制,抑制率达85.5％（t=21.3,P〈0.01）。结论MLC-2v可启动治疗基因HIF-1α及报告基因NIS在心肌细胞中特异性表达,表达的NIS蛋白具有摄碘功能,为NIS作为报告基因监测外源基因的靶向治疗奠定了基础。     

选择性上调 pSmad 3C/3L基因对人肝星状细胞增殖及 α平滑肌肌动蛋白、纤维酶原激活物抑制剂?1和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

目的观察选择性上调 pSmad 3C/3L基因对人肝星状细胞(LX?2)增殖及 α平滑肌肌动蛋白(α?SMA)、纤维酶原激活物抑制剂 ?1(PAI?1)和 Ⅰ型胶原蛋白(Collagen?Ⅰ)表达的影响。以进一步探究 pSmad 3C/3L在肝纤维化进展中的作用机制。方法采用脂质体转染的技术(FuGENE? HD)向 LX?2细胞转染野生型 Smad3基因(Smad3 WT)、 Smad3连接区磷酸化位点突变的基因(Smad3 EPSM)及 Smad3 C末端磷酸化位点突变的基因(Smad3 3S?A)3种质粒,选择性上调 LX?2细胞中 pSmad 3C/3L的表达水平,以蛋白质印迹法(Western Blot)验证转染效率并检测 LX?2细胞中 α?SMA、PAI?1和 Collagen?Ⅰ的蛋白表达水平。 MTT法检测选择性上调 pSmad 3C/3L对 LX?2细胞增殖能力的影响。结果转化生长因子 ?β1与 LX?2对照组相(TGF?β1)刺激 1h后,比,转染 3种质粒组 Smad3蛋白表达水平均升高［(0.48±0.02)(0.57±0.03)(0.60±0.02),(0.59±0.03); P＜0.05］;与 Smad3 WT组相比,转染 Smad3 EPSM质粒组 pSmad3C蛋白表达水平明显,升高［(0.33±0,.02)比(0.44±0.01)P＜0.05］,转染 Smad3 3S? A质粒组 pSmad3L蛋白表达水平明显升高［(0.36±0.01)比(0.42±0.02),P＜0.05］。 MTT结果显示,转染,Smad3 EPSM质粒可抑制 LX?2细胞增殖,而转染 Smad3 3S?A质粒可促进 LX?2细胞的增殖［吸光度值(0.48±0.03)比(0.93±0.05)P＜0.05］。 TGF?β1刺激 12 h后, α?SMA、PAI?1和 Collagen?Ⅰ在 3种质粒转染组中呈现出差异表达(P＜0.05)。结论转染 3种质,粒成功地选择性上调了 LX?2细胞中 pSmad 3C/3L的表达,选择性高表达 pSmad3L可进一步促进 TGF?β1诱导的细胞增殖反应、促进 α?SMA、PAI?1和 Collagen?Ⅰ的表达,选择性高表达 pSmad3C可抑制细胞增殖反应、降低 α?SMA、PAI?1和 Collagen?Ⅰ的表达;提示 TGF?β1诱导的 Smad3不同位点磷酸化在 LX?2细胞增殖和 α?SMA,PAI?1,Collagen?Ⅰ蛋白表达的调控中发挥重要作用,为肝纤维化的逆转提供了新思路。     

Pdx1与NeuroD1联合诱导L02细胞Nkx6.1和GLUT2的表达

目的：应用分子生物学技术,构建胰腺十二指肠同源框蛋白1(Pdx1)和神经分化因子1(NeuroD1)转录因子真核表达质粒,检测其能否在真核细胞中有效表达并诱导人肝细胞转分化的能力。方法:以人胚胎胰腺组织mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdx1和NeuroD1基因,分别克隆到真核双表达载体pIRES质粒的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pI/Pdx1/NeuroD1真核表达质粒,并转染L02细胞。用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法和Westernblotting检测目的基因及NK转录因子相关的Nkx6.1(Nkx6.1)和葡萄糖运载体2(GLUT2)的表达情况。结果:目的基因克隆正确且在真核细胞中有效表达;并可诱导肝细胞表达胰腺β细胞功能相关的Nkx6.1和GLUT2因子。结论:pI/Pdx1/NeuroD1质粒成功构建和在人真核细胞表达,并诱导人肝细胞表达β细胞功能相关的Nkx6.1转录因子和GLUT2,提示Pdx1与NeuroD1可诱导肝细胞向胰腺内分泌细胞分化。     

含人血栓调节蛋白基因重组质粒的构建和表达

目的:构建hTM真核表达质粒,并导入脐静脉内皮细胞(HUVECs)中表达,为临床血栓病的基因治疗提供实验依据和物质基础。方法:PCR法扩增hTM基因的全长表达片段,HindⅢ/EcoRⅠ酶切后与pcDNA3.1(+)/neo质粒连接成pcDNA3.1/hTM。经鉴定正确后,由阳离子脂质体包裹转染HUVECs,免疫组化检测转染后细胞hTM的表达。结果:双酶切及测序鉴定均证实hTM基因被成功克隆。pcDNA3.1/hTM经脂质体介导能有效地转染内皮细胞,转染效率约为10%左右。结论:成功构建pcDNA3.1/hTM重组质粒,并且能在内皮细胞中高效表达。为进一步的基因治疗提供物质基础。     

基因免疫制备抗人BLyS单克隆抗体及单抗特性分析

目的:基因免疫制备抗人BLyS单克隆抗体并分析其免疫学特性。方法:将人BLyS基因克隆到真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3/hBLyS,用其免疫BALB/c鼠,取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用ELISA法筛选阳性克隆,用免疫印迹和流式细胞技术进一步鉴定抗体的特异性,用双向免疫扩散鉴定单克隆抗体的类别。结果:重组质粒双酶切结果和DNA序列测定结果表明,pcDNA3/hBLyS重组质粒含有目的基因;ELISA、免疫印迹、流式细胞仪和双向免疫扩散等实验结果表明,9c10杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体可以特异性结合IFN-γ激活的人T淋巴细胞膜表面BLyS蛋白的膜外区,属于IgG1亚类。结论:获得了能够特异性结合人T淋巴细胞上BLyS蛋白膜外区的单克隆抗体,为进一步研究人BLyS与自身免疫性疾病的关系提供了条件。     

质粒DNA对大鼠骨骼肌肌质网Ca2+转运的影响

目的：观察ＤＮＡ与骨骼肌肌质网蛋白结合后对肌质网功能的影响。方法：应用差速离心分离大鼠骨骼肌肌质网,并用４５ＣａＣｌ２作为示踪剂,观察质粒ＤＮＡｐｃＤＮＡ３和ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ对肌质网钙转运功能的影响。结果：两种质粒均可明显增加肌质网Ｃａ２＋摄取,呈明显的量效关系,并且也可促进肌质网钙释放。结论：外源质粒ＤＮＡ可影响肌质网钙转运功能。     

PCA3启动CD-TK自杀基因对前列腺癌细胞特异性杀伤效应初步研究

目的 研究在前体药物作用下PCA3启动子联合CD-TK基因的真核表达载体对体外前列腺癌细胞特异性杀伤效应。方法 将已构建好pHBAd-PCA3-CD-TK真核重组质粒和对照组质粒分别转染到前列腺癌细胞、对照组细胞,并以更昔洛韦（Ganciclovir,GCV）和5-氟胞嘧啶（5-Fluorocytosine,5-FC） 作为前体药物联合使用。MTT法检测并比较体外细胞毒实验后各组细胞活力。结果 成功将pHBAd-PCA3-CD-TK转染至目标细胞,采用Real-Time PCR验证其仅能在前列腺癌细胞中表达;MTT法检测可观察到pHBAd-PCA3-CD-TK组靶细胞活力明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 pHBAd-PCA3-CD-TK真核重组质粒可在前列腺癌细胞中特异性表达并激活前体药物,体外实验中特异性杀伤前列腺癌细胞,为后续基于PCA3启动子对前列腺癌精准基因治疗打下初步研究基础。