细粒棘球蚴细胞外信号调节激酶基因克隆、序列分析及功能的初步鉴定

目的 从新疆株细粒棘球蚴中克隆细胞外信号调节激酶(EgERK1)基因,进行序列测定、生物信息学分析,蛋白表达及功能初步鉴定.方法 设计特异性引物,从新疆株细粒棘球蚴中提取总RNA,RT-PCR法扩增EgERK1基因,构建pET28a-EgERK1原核表达质粒,测序确定序列并进行生物信息学分析.构建正确的pET28a-EgERK1原核表达质粒,经诱导、表达EgERK1重组蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹检测其生物学功能.结果 RT-PCR扩增出的条带经测序,结果显示其长度为1125 bp,编码374个氨基酸,等电点为6.34,BLAST比对结果提示为一薪基因,命名为EgERK1(EU701008).同源性比较表明,EgERK1与多房棘球绦虫ERK基因(EmMPK1)同源性为95.45%,与线虫、酵母、果蝇和人类等ERK基因的同源性为43.04%～61.88%.进化树分析发现EgERK1和EmMPK1相聚集.功能分析预测EgERK1具有ERK类激酶T-X-Y结构保守区和酶激活功能域.Western印迹显示,原核诱导表达的EgERK1重组蛋白能与抗人ERK1/2抗体发生特异性免疫反应.结论 成功克隆细粒棘球蚴EgERK1新基因,发现EgERK1重组蛋白具有与ERK1/2抗体结合的功能,为进一步研究该基因在寄生虫与宿主相互作用中的功能奠定基础.     

乙型肝炎病毒X基因转化人肝细胞QSG7701的体外观察

目的 观察HBV X基因多功能蛋白(HBx)的表达对QSG7701细胞生物学特征的影响及对其的转化作用.方法 采用脂质体法分别将重组质粒pCMV/X及真核表达质粒pRe/CMVZ稳定转染QSG7701细胞,分别获得pCMV X/QSG7701、pReCMV2/QSG7701,设未转染的QSG7701细胞为对照组.Western印迹检测细胞中HBx、c-Myc及Bel-2蛋白的表达,MTT比色法、流式细胞技术、软琼脂克隆形成率实验检测细胞的生物学活性.结果HBx高表达于pCMV X/QSG7701中.pCMV X/QSG7701中c-Mye蛋白的表达水平较其他两组高,Bcl-2蛋白在3组细胞中均有表达,但表达水平差异无统计学意义.在pCMV X/QSG7701、pRcCMV2/QSG7701及未转染的QSG7701 3组细胞中,pCMV X/QSG7701组s期细胞所占百分比较后两组明显增加[分别为(28.80±2.32)%、(15.50+2.64)%、(21.50±3.66)%,LSD 0.05=3.95%,LSD 0.01=5.47%,P<0.01],其G1期细胞所占百分比较后两组明显减少[分别为(62.30±3.85)%、(78.70±4.12)%、(78.105=4.45)%,LSD 0.05=5.63%,LSD 0.01-7.79%,P<0.01],其凋亡率明显高于后两组[分别为(14.90+11 01)%、(8.91±0.48)%、(4.03±0.47)%,LSD 0.05=0.94%,LSD 0.01=1.31%,P<0.01],其细胞株的倍增时间较后两组明显缩短(分别为14 h,29 h,38 h),其软琼脂克隆形成率明显高于后两组[分别为(19.83±1.96)%,(1.764±0.03)%,(1.33±0.18)%,LSD 0.05=1.53%,LSD 0.01=2.11%,P<0.01].结论 HBx能够在体外转化人源性非瘤性肝细胞QSG7701,使细胞具有恶性化生长的倾向.     

小鼠DNA酶真核表达质粒在小鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的 将构建好的小鼠DNA酶(DNaseI)真核表达质粒转染到小鼠骨髓间充质干细胞中,观察目的基因在细胞内的表达及分泌情况.方法 采用脂质体法将已构建好的小鼠DNaseI的真核表达质粒转染人小鼠骨髓间充质干细胞中,用Western blotting法检测DNaseI基因在骨髓间充质干细胞内的表达及DNA-甲基绿比色法检测培养上清液中DNaseI的活性.结果 小鼠DNaseI的真核表达质粒能够转染入小鼠骨髓间充质干细胞中,转染效率约为30%.转染后的小鼠骨髓间充质干细胞可以表达DNaseI蛋白且分泌出具有活性的DNaseI.结论 脂质体法能够将小鼠DNaseI的真核表达质粒转染入小鼠骨髓间充质干细胞中,小鼠DNaseI基因在小鼠骨髓间充质干细胞中成功表达并分泌具有生物活性的DNaseI.     

真核表达质粒pcDNA3-HERG转染抑制血管紧张素Ⅱ诱导乳兔心肌细胞肥大

目的 探讨HERG基因真核表达质粒pcDNA3-HERG(编码人快激活延迟整流钾通道α亚单位)转染抑制血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导乳兔心室肌细胞肥大的电生理机制.方法 培养乳兔心窜肌细胞,观察10~(-7)mol/L Ang Ⅱ作用6 h和48 h心肌肥大指标(细胞体积、总蛋白含量及膜电容)、动作电位时程(APD)及钙调神经磷酸酶(CaN)活性的变化.以真核表达质粒pcDNA3-HERG转染心窒肌细胞,观察转染细胞经Ang Ⅱ诱导48 h后上述指标的变化.结果 Ang Ⅱ作用6 h,心室肌细胞动作电位复极达90%时程(APD_(90))延长19.8%(P<0.01),而此时并无心肌肥大和CaN活性增加.Ang Ⅱ作用48 h,心窒肌细胞APD_(90)延长22.1%(P<0.01),细胞体积、总蛋白含量、膜电容以及CaN活性分别增加40.4%、40.4%、38.2%、114.7%(P均<0.01).pcDNA3-HERG转染可过度表达I_(HERG)其尾电流密度约为正常对照组快激活延迟整流钾电流(I_(Kr))尾电流密度的3.6倍(P<0.01),可促进复极,明显缩短AngⅡ引起的APD_(90)延长(P<0.01),显著抑制AngⅡ诱导心肌肥大和CaN活性增加.结论 AngⅡ诱导乳兔心室肌细胞肥大过程中,APD延长并非继发于而是早于心肌肥大.APD延长,继而导致Ca~(2+)内流和胞内Ca~(2+)增加,激活CaN信号通路可能在AngⅡ诱导心肌肥大中起重要作用.     

发现一株产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌

目的 研究1株亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌的耐药机理。方法 采用浓度梯度法（Etest）测定细菌对各抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）。通过等电点分析（IEF）、质粒抽提、接合试验、转化试验、聚合酶链反应（PCR）扩增及耐药基因克隆测序分析细菌编码的B内酰胺酶。结果临床分离的肺炎克雷伯菌等电点显示3条β内酰胺酶条带，分别为5．4、6．7和8．2。PCR扩增测序临床分离菌含TEM-1（pI，5．4）、SHV-12（pI，8．2）和KPC-2（pI，6．7）β内酰胺酶编码基因。转化菌只有一条β内酰胺酶条带，为6．7。从转化菌质粒（60000bp）上获得1500bp的克隆片段，测序证实其为KPC-2编码基因。结论 亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌的质粒上携带水解碳青霉烯类抗生素的A类2f组KPC-2酶的编码基因。     

丙型肝炎病毒全长基因嵌合萤光素酶重组质粒转染细胞系的建立与初步应用

目的 构建能产生较高效价重组病毒的HCV细胞感染模型,为HCV致病机制的研究和抗病毒药物的筛选提供一个有效的体外细胞培养系统.方法 利用PCR技术在HCV NS5A C端插入海肾萤光素酶( Renilla Luciferase,Rluc)报告基因,并引入能提高HCV效价的突变,酶切鉴定重组基因序列构建成功后,转染入...     

鼠疫菌6 kb质粒核酸序列同源性比对分析

目的 分析云南省鼠疫菌6 kb(pYC)质粒核酸序列与GenBank中公开报道的多种细菌序列的同源性.方法 通过美国国立图书馆网站序列比对搜索工具(BLAST),对鼠疫菌pYC质粒全序列和开放式读码框架(ORFs)以及翻译蛋白进行核酸与核酸、蛋白与蛋白比对分析.结果 pYC质粒部分基因与宋内志贺菌质粒pKYM具有97.1%的同源性,与流感嗜血杆菌基因有92.1%的同源性,与伤寒沙门杆菌基因LT2和pIMVS1分别具有88.2%和87.2%的同源性,与大肠埃希菌0157:H7、K-12、ECOR31株局部基因分别具有81.4%、81.4%和84.7%的同源性.pYC质粒ORFs翻译蛋白ORF1与副鸡嗜血菌复制蛋白B具有47.2%的相似性,ORF4与大肠埃希菌推定蛋白具有52.7%的相似性,ORF5与假结核菌TriE蛋白具有48.3%的相似性,ORF6与大肠埃希菌PilxS/VirB5相似蛋白具有42.3%的相似性、与小肠结肠炎耶尔森菌TriD蛋白具有38.5%的相似性,ORFIO与伤寒沙门杆菌LT2细胞质蛋白具有83.1%的相似性.与大肠埃希菌0157:H7推定蛋白具有81.9%的相似性.ORF11与大肠埃希菌K12诱导损伤蛋白J具有81.4%的相似性.结论 pYC质粒DNA序列与肠杆菌科部分基因具有高度同源性,可能编码类似埃希菌属和耶尔森菌属推定蛋白、诱导损伤蛋白、TriD和TriE蛋白、Pilx5/VirB5相似蛋白.     

pGenesil-siHBV X 对 HepG2.2.15 细胞 HBV 表达和复制的抑制效果研究

 目的 研究针对HBV X基因区设计的小干扰RNA（siRNA）表达载体质粒pGenesil-siHBV X 对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性。方法 针对HBV X区设计siRNA表达载体质粒pGenesil- siHBV X。分别用培养液（空白对照）、脂质体Metafectene、pGenesil 空载体、pGenesil-siHK（阴性对照）、pGenesil-siAFP（特异性对照）、pGenesil-siHBV X处理或转染HepG2.2.15细胞各3次。于每次转染后24 h，取各组细胞培养上清液，用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量，用化学发光法检测AFP含量，用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平。 结果 pGenesil-siHBV X转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达，且抑制作用随转染次数增加而增强。第3次转染后，pGenesil-siHBV X组细胞上清液中 HBsAg、 HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为（6.26 ± 1.07）ng/ml 、（0.13 ± 0.05）Ncu/ml和（3.01 ± 0.40）×107拷贝/ml，与空白对照组的（22.50 ± 1.39）ng/ml、（1.12 ± 0.11）Ncu/ml和（12.33 ± 1.28）×107拷贝/ml比较，差异有统计学意义（t值分别为12.80、12.21、9.71，P < 0.05）；pGenesil-siHBV X 转染不影响细胞对AFP的表达（t = 0.18，P = 0.86）。结论 pGenesil-siHBV X可以有效和特异地抑制HepG 2.2. 15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达。     

艰难梭状杆菌肠毒素B在巨大芽孢杆菌中的表达和鉴定

目的 获得高纯度和具有生物活性的重组肠毒素B(rTcdB).方法 以艰难梭状芽孢杆菌染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增得到全长TcdB基因并克隆至穿梭载体pHis1522.构建的质粒经直接测序验证无误后,转化巨大芽孢杆菌原生质体,在木糖的诱导作用下进行TcdB的表达、纯化及生物活性鉴定.结果 从细菌培养液中纯化得到rTcdB,浓度达到5～10 mg/L,其相对分子质量与天然的TcdB蛋白接近,生物活性与天然的TcdB蛋白相似.结论 在巨大芽孢杆菌中成功表达了具有完整结构和活性的艰难梭状芽孢杆菌TcdB重组蛋白.

Abstract：

Objective To express and purify recombinant and biologically active Clostridium difficile toxin B (rTcdB). Methods The genes of TcdB were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using chromosomal DNA from a toxigenic strain, and cloned into a shuttle vector pHis1522.The sequences of TcdB genes in the vector were verified by DNA sequencing. The construction was transformed into Bacillus megaterium protoplasts and the protein expression was driven by a xylose promoter. The purified protein was tested for biological activity. Results rTcdB was successfully purified from bacterial crude extracts. Approximately 5-10 mg of highly purified recombinant toxin was obtained from one liter of bacterial culture. The expressed rTcdB had molecular mass similar to the native toxin, and its biological activity was proved to be similar to its native counterpart after an extensive examination. Conclusion rTcdB with biological activities is successfully expressed in Bacillus megaterium.