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994.
目的:构建E6AP基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并检测其对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法利用RNA干扰(RNAi)技术设计并合成两条E6AP基因的siRNA,并将其与siRNA表达载体pSIH-H1连接。经过酶切和测序鉴定成功后,人胚肾细胞293T包装E6AP siRNA的慢病毒,然后感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低E6AP表达的稳定细胞株。稳定细胞株建立后通过实时定量PCR( qRT-PCR)和Western 印迹等方法检测RNAi的干扰效果,并利用细胞生长实验检测E6AP siRNA对乳腺癌细胞生长的影响。结果 DNA测序证明,成功构建了E6AP siRNA的表达载体。实时定量PCR和Western 印迹实验证明,构建的siRNA确能有效抑制E6AP基因的表达,并建立了敲低E6AP表达的稳定细胞株。生长实验表明,E6AP siRNA可有效抑制细胞的生长。结论成功构建E6AP基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效地抑制E6AP基因的表达,且抑制细胞ZR75-1的生长。 相似文献
996.
目的 筛选Toll样受体2(Toll-like receptor 2, TLR2)通路下游与辐射防护调控相关的关键miRNA,并探讨miR-21功能。方法 以60Co γ射线对野生型(wild type, WT)、TLR2 KO小鼠分别进行6.0、7.0、8.0 Gy全身照射,观察小鼠生存情况;通过转录组测序筛选骨髓细胞内TLR2通路下游关键miRNA,并通过QT-PCR验证其表达。过表达/敲低该miRNA后检测其生物学功能。结果 6.0、7.0、8.0 Gy全身照射后,TLR2 KO小鼠较WT小鼠辐射敏感性增加(χ2=4.490、13.100、7.928,P<0.05),骨髓移植实验证明TLR2 KO小鼠辐射敏感性增加与照射后骨髓细胞损伤有关(χ2=4.291,P<0.05)。转录组测序筛选到差异基因55个([log2 Fold Change]>0.95,Q<0.05),其中上调基因28个,下调基因27个;定量PCR实验确定TLR2 KO(t=9.420,P<0.01)与MyD88 KO(t=10.700,P<0.01)小鼠骨髓细胞内miR-21表达下调。PAM3CSK4刺激后小鼠骨髓细胞内白介素6(IL-6)(t=13.790,P<0.05)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)(t=14.280,P<0.05)表达量上调且依赖于TLR2。miR-21过表达可以促进EL4(t=5.951,P<0.05)和NIH/3T3(t=4.786,P<0.05)辐射后细胞活力,抑制WT小鼠(t=4.842,P<0.05)和TLR2 KO小鼠(t=10.520,P<0.05)BMCs辐射后细胞凋亡。miR-21敲低后降低EL4(t=4.815,P<0.05)和NIH/3T3(t=4.042,P<0.05)辐射后细胞活力。结论 miR-21在TLR2辐射防护进程中具有关键调控作用,其作用机制可能与上调IL-6与TNF-α有关。 相似文献
997.
干扰HERG钾通道表达可抑制成神经细胞瘤细胞增殖 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制HERG基因的表达,探讨HERG基因编码钾通道对人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)存活及增殖的影响。方法:构建发卡状RNA干扰质粒(shRNA-HERG)转染SH-SY5Y细胞,再分别使用半定量RT-PCR和Western印迹方法观察shRNA-HERG对SH-SY5Y细胞中HERG基因mRNA及其编码蛋白表达的干扰效果。利用SH-SY5Y细胞的生长曲线和集落形成实验,观察转染shRNA-HERG质粒对SH-SY5Y细胞存活及增殖能力的影响。结果:转染shRNA-HERG干扰质粒后,SH—SY5Y细胞中HERG基因的mRNA水平及其编码的钾通道蛋白表达水平显著下降。与对照组相比,shRNA—HERG使SH-SY5Y细胞生长曲线明显下压,细胞倍增时间延长136.8%。集落形成实验结果显示,无论接种细胞数为50,100或200,shRNA-HERG组克隆形成率均显著下降,与shRNA-control组和未干扰组相比,差异有统计学意义(P〈0.01)。结论:所构建的shRNA-HERG表达质粒能有效抑制HERG基因编码钾通道蛋白的表达,明显抑制SH-SY5Y细胞的生长和增殖。 相似文献
998.
不同强度运动后大鼠心肌细胞热休克蛋白72mRNA的表达 总被引:4,自引:1,他引:4
目的 :探讨不同运动强度和持续时间运动对大鼠心肌细胞热休克蛋白 72mRNA表达的影响。方法 :分别使SD大鼠进行低强度 (6 0 %VO2 max)、中等强度 (75 %VO2 max)和高强度 (85 %VO2 max)跑台运动 1天、2天和 3天 ,在末次运动结束后 2 4小时以RT -PCR法检测大鼠心肌细胞热休克蛋白 72mRNA的表达。结果 :在安静情况下大鼠心肌细胞存在HSP72mRNA的基础结构性表达 ;低强度运动 1天后心肌细胞HSP72mRNA表达与对照组相比无显著性差异 ,但随着运动时间的延长 ,HSP72mRNA表达逐渐增加 ;中等强度运动后心肌细胞HSP72mRNA表达随运动持续时间的延长显著增加 ,但运动 2天和 3天组表达量无显著性差异 ;大强度运动后心肌细胞HSP72mRNA表达随运动持续时间的延长显著增加。结论 :运动可以造成心肌细胞HSP72mRNA的表达增加 ,不同强度运动诱导心肌细胞HSP 72mRNA表达程度不同 ,且与运动持续时间存在内在关系。 相似文献
999.
Stat3靶向RNA干扰重组体的构建及鉴定 总被引:4,自引:0,他引:4
目的设计针对Stat3的发夹样RNA干扰重组体,通过脂质体转染结肠癌细胞HCT116观察其干扰效果,为探索肿瘤基因治疗的新途径奠定基础。方法设计针对Stat3编码区的有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,克隆到载体Pavu6+27中构建重组体Pavu6+27-Stat3,再对重组质粒进行酶切鉴定、DNA测序分析。脂质体法转染重组体至大肠癌HCT116细胞株中,以空质粒(Pavu6+27)转染为对照;RT-PCR法观察Stat3基因表达改变。结果酶切鉴定和测序分析均提示Stat3靶向RNA干扰重组体的构建成功,Pavu6+27-Stat3转染后HCT116细胞Stat3基因表达较空载体Pavu6+27转染的对照组显著下降。结论Stat3靶向RNA干扰重组体成功构建,并能有效抑制HCT116细胞中Stat3基因表达。本实验为下一步利用RNAi技术沉默肿瘤细胞中Stat3基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡或抑制其增生,为探索肿瘤基因治疗的新途径打下基础。 相似文献
1000.
目的观察RNA干扰(RN加)技术能否有效抑制大肠癌LoVo细胞株表皮生长因子受体(EGFR)的表达以及对细胞增殖的影响。方法构建质粒表达载体pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2;脂质体瞬时转染后24、48、72、96、144h实时荧光定量PCR(Real Time PCR)和Western blot检测EGFR表达,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,并绘制细胞生长曲线;分5组:A组:Lov0细胞组;B组:Lipofectamine2000组;C组:对照载体HK组;D组:pU6-EGFR-shRNA-1组;E组:pU6-EGFR-shRNA-2组。结果D组E组细胞转染shRNA后mRNA和蛋白表达降低,G0~G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞凋亡率增加,对数生长期延迟,以48h效果最显著,和A组B组C组比较差异有统计学意义(P〈0.05);但随着时间的推移其干扰作用降低。结论两条EGFR-shRNA均可有效抑制大肠癌LoVo细胞EGFR表达,阻滞更多的细胞位于Go~G1期,促进细胞凋亡而抑制细胞增殖。 相似文献