基于Wnt/β联蛋白信号通路探讨EphB2抑制剂对皮肤鳞状细胞癌的影响及作用机制

【摘要】 目的 采用分子对接法筛选酪氨酸蛋白激酶受体B2（EphB2）小分子抑制剂,研究其对皮肤鳞状细胞癌（CSCC）的影响及可能机制。方法 利用 Schrodinger对接工具预测EphB2蛋白的三维结构及其配体结合位点,通过分子对接进行高通量虚拟筛选EphB2抑制剂,通过体内外实验验证筛出的EphB2抑制剂山奈苷与芦荟大黄素（AE）抗CSCC的作用及机制。体外实验中,将人CSCC细胞系A431、SCL-1及人永生化表皮细胞HaCaT分别分为空白对照组、二甲基亚砜组、AE组与山奈苷组,通过MTT实验（AE浓度：20、40、80、160 μmol/L;山奈苷浓度：12.5、25、50、100 μmol/L）、划痕实验及Transwell小室实验（AE浓度：80 μmol/L,山奈苷浓度：50 μmol/L）分析EphB2抑制剂对CSCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响。体内实验中,SPF级BALB/c雌性裸鼠皮下注射0.2 ml A431细胞悬液,待成功长出瘤体以后,随机分为4组（n = 6）,空白对照组、二甲基亚砜组、AE组（腹腔注射AE 20 mg·kg-1·d-1 AE）与山奈苷组（腹腔注射山奈苷25 mg·kg-1·d-1）;每周测量裸鼠的肿瘤大小和体重;连续给药28 d后,剥取裸鼠移植瘤进行HE染色,qRT-PCR与Western blot分析AE和山奈苷对裸鼠移植瘤中上皮钙黏着蛋白、波形蛋白、磷酸化葡萄糖合成激酶3β（p-GSK-3β）、β联蛋白及GSK-3β表达的影响。组间比较采用单因素方差分析及t检验。结果 筛选出对EphB2具有较高抑制活性的两个小分子化合物AA-504/20999031（山奈苷）和AA-466/21162055（AE）。MTT实验结果表明,与HaCaT细胞相比,AE对SCL-1和A431细胞具有强烈的细胞毒性,且随AE浓度升高毒性变强（F = 17.95,P＜0.001）,作用48 h时,IC50分别为124.59 μmol/L和80.85 μmol/L;山奈苷对SCL-1和A431细胞具有强烈的细胞毒性,且随山奈苷浓度升高毒性变强（F = 11.34,P＜0.001）,作用48 h时,IC50分别为119.64 μmol/L和64.96 μmol/L。划痕实验显示,与二甲基亚砜组细胞迁移距离（88.1±1.4） μm相比,AE组和山奈苷组A431细胞迁移距离［（36.7±1.0） μm和（44.7 ± 3.5） μm］显著缩短（F = 52.34,P < 0.001）,而HaCaT细胞迁移距离差异无统计学意义（F = 1.73,P = 0.238）。Transwell小室实验表明,与二甲基亚砜组A431细胞跨膜细胞数量（195.3 ± 5.7）相比,AE组和山奈苷组A431细胞显著抑制（145.0 ± 2.5和94.7 ± 4.1,F = 72.85,P < 0.001）,而对HaCaT细胞则无明显抑制作用（F = 3.91,P = 0.055）。动物实验表明,与二甲基亚砜组裸鼠移植瘤体积（841.88 ± 84.63） mm3相比,AE组和山奈苷组显著下降［（407.42 ± 70.37） mm3与（368.77 ± 62.7） mm3,F = 73.78,P < 0.001］。HE染色证实,AE和山奈苷干预可改善其病理变化。qRT-PCR与Western印迹结果显示,AE和山奈苷明显上调瘤体组织中上皮钙黏着蛋白与p-GSK-3β mRNA和蛋白表达水平（均P < 0.001）,下调波形蛋白、β联蛋白及GSK-3β mRNA和蛋白表达水平（均P < 0.001）。结论 分子对接筛选的小分子抑制剂与EphB2可形成稳定复合物,并通过影响 Wnt/β联蛋白通路诱导的上皮间质转化现象来抑制CSCC进程。     

DKK1与β-Catenin在食管鳞癌中的表达及意义

目的探讨DKK1与β-Catenin在食管鳞癌中的表达及与临床病理特征的关系。方法采用免疫组化二步法检测DKK1,β-Catenin在54例食管鳞癌中的表达情况,。结果 DKK1在食管鳞癌高中和低分化组中阳性率分别为82.14%和38.46%,在TNMⅠ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期组中阳性率分别为43.47%和74.19%,肿瘤浸润深度分组（浅肌层,深肌层,外膜）中,DKK1阳性率分别为50.00%,42.86%,74.19%,在淋巴结转移组与非转移中DKK1阳性率分别为76.00%和48.28%,统计学显示,以上四个变量均有显著差异（P〈0.05）。β-catenin在食管鳞癌高中和低分化组中阳性率分别为46.42%和88.46%,淋巴结转移组与非转移中阳性率分别为44.00%和86.21%,统计学显示两变量具有显著差异（P〈0.05）。结论 DKK1,β-catenin在食管鱗癌分化、增殖,转移中起一定的作用,DKK1作为Wnt/β-Catenin经典信号传导通路的拮抗剂,有可能成为新的药物作用靶点。     

Expression of cadherins and catenins correlates with distinct histologic types of ovarian carcinomas

Alterations in the cadherin-catenin expression and activation of the Wnt signaling have been related to the pathology of ovarian carcinomas. Here, we evaluated the immunoreactivity of cadherins (E-, P-, and N-cadherin and cadherin-11) and catenins (alpha-, beta-, and gamma-catenin and p120) in 86 ovarian tumors. We found significant differences in the expression of all cadherins and catenins among the distinct histologic tumor types. Clear cell tumors were rarely N-cadherin- and P-cadherin-positive and showed reduced membranous expression in all the catenins; Serous carcinomas were frequently N-cadherin- and P-cadherin-positive, mucinous tumors strongly expressed E-cadherin and the catenins in the membrane, and endometrioid tumors characteristically expressed nucleocytoplasmic beta-catenin in most of the cases. We next studied whether allelic losses in the chromosomal regions containing various cadherin genes (16q22) or APC gene (5q21) occurred in ovarian tumors and observed a high frequency of loss of heterozygosity in 16q22 (78%) and 5q21 (33%) regions, but there were no differences among the tumor types analyzed. Finally, we also assessed the molecular alterations responsible for beta-catenin nuclear accumulation in endometrioid tumors by screening for mutations in AXIN1, AXIN2, APC, and KRAS genes. Mutations in KRAS were observed in 2 of 19 tumors, but no mutations were detected in AXIN1, AXIN2, or APC genes. Only beta-catenin gene mutations were associated with nuclear beta-catenin staining in these tumors. In conclusion, different cadherin-catenin expression patterns are associated with distinct histologic types. Oncogenic Wnt signaling plays a role only in endometrioid tumors, where beta-catenin mutations seem to be the main cause of its aberrant expression.     

MALAT1、COX-2、β-catenin、MMP-3、MMP-9等基因在结直肠癌发生发展中的意义

 目的 探讨人肺腺癌转移相关转录因子1（MALAT1）、环氧合酶-2（COX-2）、β-连环素（β-catenin）、基质金属蛋白酶（MMP）-3、MMP-9等基因在结直肠癌发生发展中的意义。 方法 收集新鲜结直肠癌组织标本及其对应癌旁组织标本各30例,采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法检测MALAT1、COX-2、β-catenin、MMP-3、MMP-9的mRNA表达水平,并与患者性别、年龄、癌胚抗原(CEA)、细胞免疫因子（CD4和CD8）、临床分期、肿瘤侵袭转移程度等进行相关性分析。 结果 MALAT1、COX-2、β-catenin、MMP-9在癌组织和癌旁组织中的表达差异均有统计学意义（P<0.05）,MMP-3则无统计学意义（P>0.05）。MALAT1、COX-2、MMP-9和β-catenin在癌组织中的表达量分别是癌旁组织表达量的2.22倍、1.86倍、2.16倍、0.58倍 (P<0.01)。MALAT1（癌/癌旁）的表达差异与β-catenin（癌/癌旁）的表达差异呈负相关（r＝-0.346,P=0.030）,MMP-9（癌/癌旁）的表达差异与β-catenin（癌/癌旁）的表达差异则呈正相关(r=0.312,P=0.047)。COX-2（癌/癌旁）与MMP-9（癌/癌旁）在男女患者之间的差异均有统计学意义（P=0.047;P=0.018）;COX-2（癌/癌旁）在CEA上升与未见改变的患者之间的差异也有统计学意义（P=0.021）。结论 MALAT1、COX-2、MMP-9、β-catenin在结直肠癌的发生发展中有重要意义,而MMP-3无重要参考价值;MALAT1和β-catenin的负相关性及MMP-9和β-catenin的正相关性说明其在结直肠癌的发生发展中存在一定的相互作用关系;COX-2（癌/癌旁）和MMP-9（癌/癌旁）在男女患者中的差异提示二者影响男女患结直肠癌的概率;检测COX-2可在一定程度上辅助肿瘤标志物CEA对结直肠癌的诊断。