脉冲电磁场对成骨细胞-破骨细胞复合培养体系中成骨细胞膜电位及细胞内钙离子的影响

目的：探讨脉冲电磁场(pulsed electric-magnetic fields，PEMF)对体外培养成骨细胞-破骨细胞复合体系中成骨细胞膜电位及细胞内游离钙离子浓度的影响，为脉冲电磁场治疗骨质疏松寻找理论依据。方法：体外分离、培养1d龄SD乳鼠颅骨成骨细胞和四肢骨破骨细胞，利用共育培养板将两者培育在同一环境中；实验分空白组、维拉帕米组、河豚毒素组及维拉帕米+河豚毒素组，根据荧光探针DiBAC4(3)及Fluo-3／AM能与活细胞细胞膜及胞内钙离子特异性动态结合后发出荧光的特性，分别对各组成骨细胞进行膜电位和钙离子荧光染色，染色后利用流式细胞仪(flow cytometry，FCM)技术分别测量各组行PEMF处理前后荧光强度的改变，以间接反应细胞膜电位、细胞内钙离子浓度的变化。结果：在行PEMF处理前各组细胞细胞膜电位及细胞内钙离子浓度稳定在一定基线水平(空白组细胞膜电位及细胞内钙离子浓度的荧光基准值分别为：(37．68&;#177;1．81)和(164．24&;#177;2．82)，而在PEMF作用后，空白组细胞胞内膜电位荧光值于40s后开始升高，150s左右达峰值(75．05&;#177;2．27)，表明细胞膜电位出现了去极化；而钙荧光值的升高出现在PEMF作用后约60s时，120s后达到峰值(237．22&;#177;2．67)，且升高后在PEMF作用过程中一直稳定在一定水平。PEMF使细胞出现去极化的效应能被钠通道阻断剂河豚毒素所阻断，而钙通道阻断剂维拉帕米对其没有明显的影响；但河豚毒素及维拉帕米均能使PEMF升高细胞内钙离子浓度的效应受阻。结论：PEMF作用于成骨细胞钠离子通道引致细胞出现去极化，从而开放电压依赖型钙离子通道而升高细胞内钙离子浓度，钙离子作为细胞内第二信使，介导PEMF对成骨细胞功能的调节作用。     

激素诱发骨坏死的机制：随机对照研究

目的：探讨糖皮质激素诱发骨坏死的机制。方法：将兔复制Yamamoto氏骨坏死模型，分为对照组(4只)，2，4，6和8周组，每组各5只，按照不同时间处死取材。利用双光子骨密度仪测量股骨头部的骨质密度值。收集激素性骨坏死患者的病理标本21例，以无骨代谢疾病患者的股骨标本为对照，免疫组化染色观察激素性骨坏死股骨头局部骨保护素(OPG)／破骨细胞生成抑制因子(OCIF)蛋白的表达改变。结果：糖皮质激素给药后，继发于OPG表达减低(P&;lt;0．01)和破骨细胞异常增生后，局部出现渐进性骨丢失(P&;lt;0．05)；与正常对照比较，激素性骨坏死患者的股骨头局部OPG表达明显减低(P&;lt;0．05)。结论：糖皮质激素抑制骨骼局部的OPG表达，使破骨细胞异常增殖，从而出现骨丢失。     

骨细胞 Cx43 在膝关节响应力学过载中的作用

目的 探究骨细胞连接蛋白43（connexin43,Cx43）通道在力学过载对小鼠膝关节影响中的作用。方法 对15周龄骨细胞特异Cx43转基因小鼠（R76W：间隙连接功能抑制而半通道功能促进;Δ130-136：间隙连接和半通道都被抑制）及同窝野生型小鼠左膝关节施加单次应变（ε=1.764 62）,右膝关节作为对照。1周后分析小鼠步态,评价小鼠膝关节骨与软骨情况。抑制MLO-Y4骨细胞Cx43通道功能后进行循环拉伸应变,检测相关因子表达。收集条件培养基培养ATDC5软骨细胞,检测相关基因表达和成骨分化能力。结果步态分析显示,Cx43通道抑制没有明显影响小鼠步态。但转基因小鼠关节股骨端OARSI评分显著增加,骨小梁面积占比更小。抑制MLO-Y4细胞Cx43通道降低了ADAMTS5和II型胶原表达,增强其成骨分化的能力。结论 骨细胞Cx43通道能够响应力学过载,影响软骨细胞关键基因表达,并参与其成骨分化过程的调控,影响软骨对力学过载的响应。研究结果为骨关节炎的防治提供新思路。     

激素性股骨头坏死早期细胞凋亡相关基因表达及阿仑磷酸钠的干预

背景：近年研究发现激素性股骨头坏死病例中凋产的骨细胞增多，因此认为激素性股骨头坏死是骨细胞凋亡所致，而并非缺血性坏死。目的：观察大鼠激素性股骨头坏死早期bcl-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific protease3，caspase-3）的表达，以及阿仑磷酸钠的干预效果。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006—03／200702在吉林大学基础医学院病理实验室完成。材料：健康Wister大鼠100只，随机分为正常对照组、激素模型组、藻酸双酯钠组、阿仑磷酸钠组、联合用药组，20只，组。藻酸双酯钠片为吉林东丰制药厂产品，阿仑磷酸钠为杭州默沙东制药有限公司产品。方法：除正常对照组外，其余4组大鼠均给予醋酸泼尼松龙臀肌注射建立激素性股骨头坏死模型。藻酸双酯钠组、阿仑磷酸钠组分别灌服对应药物，联合用药组灌服藻酸双酯钠＋阿仑磷酸钠。各组肌注用药1次／周，灌服药1次，d，实验持续6周。所有大鼠均强迫间断站立，4h／d。主要观察指标：光镜观察股骨头病理变化。S．P免疫组织化学染色法检测股骨头组织bcl-2、caspase．3的表达。结果：给药第4周与正常对照组比较，激素模型组股骨头坏死现象明显，骨小梁变细甚至断裂，空骨陷窝数量明显增多（t=-2．629，P〈0．01）；藻酸双酯钠组骨小梁和空骨陷窝数量介于前2组之间（t-=1．713，P〈O．01）；阿仑磷酸钠组、联合用药组骨小梁和空骨陷窝数量接近正常对照组忙1．462，t=-1．657，P〉0．05）。与激素模型组比较，藻酸双酯钠组、阿仑磷酸钠组、联合用药组股骨头组织bcl-2阳性细胞率均明显升高（t=-2．146，P〈0．05；t=-2．815，P〈0．01；t=-2．947，P〈0．01），caspase、3阳性细胞率均明显降低（t=-2．97，P〈0．叭；t=-2．462，P〈0．01；t=-I．854，P〈0．05），其中阿仑磷酸钠组圾联合用药组升高尤为明显（t=2．503，t=-1．959，P〈0．051。结论：大剂量激素可能通过抑制bcl-2表达和促进caspase-3表达引起股骨头坏死。阿仑磷酸钠可能通过与其相反的途径来防止骨细胞凋亡，从而预防早期激素性股骨头坏死。     

肾原发性破骨细胞样巨细胞瘤1例报道及文献复习

目的探讨肾原发性破骨细胞样巨细胞瘤(OGCT)的临床病理特征和生物学行为。方法对1例肾原发性OGCT进行临床病理和免疫组化观察及文献复习。结果老年女性,无痛性血尿1个月,CT示左肾盂占位。切除标本为红色息肉样肿物,突出于左肾盂和肾盏内,息肉宽基底与肾盏处实质相连,肿瘤由单核间质细胞和破骨细胞样巨细胞组成,瘤细胞CD68、Vim、S100和α1ACT( ),CK(-)。结论肾原发的OGCT是一种罕见肿瘤。其恶性程度应结合组织结构特点、浸润、转移等生物学行为因素综合考虑。该瘤尚可伴随某些恶性肿瘤出现。     

不同体积分数血清对培养原代破骨细胞噬骨能力的影响

目的:改变培养液中血清的浓度,观察破骨细胞形态结构,并比较不同体积分数血清对培养的原代破骨细胞噬骨能力的影响。方法:实验于2007-03/06在沈阳医学院中心实验室完成。①实验材料:选取清洁级新生24hWistar大鼠6只;胎牛血清(天津灏洋);新鲜成年牛股骨皮质(市售)。②实验过程:取新鲜成年牛股骨皮质,用磨片机磨成厚50μm的1cm×1cm骨片;取新生大鼠四肢长骨,分离破骨细胞,并用不同体积分数血清(分别为0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25)培养原代破骨细胞。③实验评估:第1,6天倒置显微镜下计数,第3天取细胞玻片观察细胞形态结构;扫描电镜观察不同体积分数血清培养的破骨细胞在牛骨皮质上产生骨陷凹面积的差异。结果:①破骨细胞的分离培养结果:分离培养的破骨细胞数量较少,体积大,胞浆丰满,细胞突起延展,细胞核呈圆形或椭圆形,积聚在细胞中央或排列在细胞周边。②不同体积分数血清培养液中骨片上吸收陷窝深度比较:随着培养液中血清体积分数的增加,骨片上陷窝深度逐渐增加,在培养液中血清体积分数为0.15时,骨片上陷窝最深,此后随着培养基血清体积分数的增加,形成骨陷凹的深度无明显增加。结论:血清体积分数为0.15培养基培养的破骨细胞在牛皮质骨片上产生骨陷凹最深,噬骨能力最强。     

Eph家族蛋白调节骨稳态研究进展

骨重建机制复杂,调控因素众多,整个过程受到破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成共同调节,两者的综合因素导致了骨重建的发生。近期研究发现,促红细胞生成素产生的肝细胞（Eph）受体中的个别成员在调控骨耦联机制中起着重要作用,这将为阐释骨重建的具体机制提供一个新的方向。该文就Eph家族蛋白的组成、分子特点及在骨重建中的具体调控机制作一综述。     

唑来膦酸钠在抑制钛颗粒诱导骨溶解中作用的体外实验研究

目的：研究唑来膦酸钠（ ZOL）对钛颗粒诱导的骨溶解的影响。方法分离6～8周C57BL/6J小鼠长骨中的前体破骨细胞（ OCP）并分为6组,A组：OCP＋细胞培养液,B组：OCP＋巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）＋NF-κB 受体活化因子配体（RANKL）＋细胞培养液,C组：OCP＋钛颗粒＋细胞培养液,D组：OCP＋上清液（钛颗粒刺激巨噬细胞24 h后上清液）＋细胞培养液,E组：OCP＋M-CSF＋RANKL＋ZOL＋细胞培养液,F组：OCP＋上清液＋ZOL＋细胞培养液。每组细胞分别接种在玻璃盖玻片、皮质骨磨片和含骨检测表面的96孔板上,10 d后检测玻璃盖玻片上细胞抗酒石酸磷酸酶（ TRAP）的表达及皮质骨磨片上骨吸收陷窝的形成,并以骨检测表面的骨吸收面积为指标比较各组破骨细胞的骨吸收活性。结果 B组、D组、E组和F组的OCP均能分化为能被TRAP染色成阳性的破骨细胞并形成骨吸收陷窝,其余组均未发现TRAP染色阳性的破骨细胞和骨陷窝。加入ZOL的F组骨吸收面积（5.54％±1.25％）较D组（10.34％±1.69％）明显减少,差异具有统计学意义（t＝5.61,P＜0.01）。结论在体外实验中钛颗粒并不能直接刺激前体破骨细胞向破骨细胞转化;唑来膦酸钠可以抑制钛颗粒诱导的骨溶解作用。     

Sinomenine induces apoptosis in RAW 264.7 cell- derived osteoclasts in vitro via caspase-3 activation

Aim： Sinomenine （SIN） is an alkaloid found in the roots and stems of Sinomenium acutum, which has been used to treat rheumatic arthritis in China and Japan. In this study we investigated the effects of SIN on osteoclast survival in vitro and the mechanisms of the actions. Methods： Mature osteoclasts were differentiated from murine monocyte/macrophage cell line RAW264.7 through incubation in the presence of receptor activator of NF-KB ligand （RANKL, 100 np=VmL） for 4 d. The cell viability was detected using the CCK-8 method. The survival and actin ring construction of the osteoclasts were scored using TRACP staining and phalloidin-FITC staining, respectively. The apoptosis of the osteoclasts was detected by DNA fragmentation and Hoechst 33258 staining, and the cell necrosis was indicated by LDH activity. The activation of caspase-3 in osteoclasts was measured using Western blotting and the caspase-3 activity colorimetric method. Results： SIN （0.25-2 mmol/L） inhibited the viability of mature osteoclasts in dose-dependent and time-dependent manners, but did not affect that of RAW264.7 cells. Consistently, SIN dose-dependently suppressed the survival of mature osteoclasts. The formation of actin ring, a marker associated with actively resorbing osteoclasts, was also impaired by the alkaloid. SIN （0.5 mmol/L） induced the apoptosis of mature osteoclasts, which was significantly attenuated in the presence of the caspase-3 inhibitor Ac-DEVD-CHO. SIN increased the cleavage of caspase-3 in mature osteoclasts in dose-dependent and time-dependent manners. Furthermore, SIN dose- dependently enhanced caspase-3 activity, which was blocked in the presence of Ac-DEVD-CHO. Conclusion： Sinomenine inhibits osteoclast survival in vitro through caspase-3-mediated apoptosis, thus it is a potential agent for treat- ing excessive bone resorption diseases.     

In vitro osteoclast-suppressing effect of sodium ibandronate

Background  Bisphosphonates (BPs) have been reported to reduce local recurrence in giant cell tumor (GCT) of bone because of their osteoclast-suppressing effect; however, the optimal mode of delivery and the dose and duration of treatment of BPs remain to be established. To address these issues, it is first necessary to clarify the manner of action of BPs on osteoclasts. We herein evaluated the osteoclast-suppressing effect of sodium ibandronate in vitro.

Methods  Mouse osteoclasts (OCLs) were generated in vitro using mouse bone marrow mononuclear cells. First, various concentrations of sodium ibandronate and equal amounts of phosphate-buffered saline were added to cell culture media. The number of multinucleated cells (over three nuclei) was recorded in each group, OCL formation was compared, and the most effective concentration of sodium ibandronate was determined. Then, high concentrations of sodium ibandronate were added to the experimental cell culture media; no ibandronate was given in the control group. Comparisons were made between the two groups in terms of OCL adhesion, migration, and bone resorption.

Results  OCL formation was suppressed by sodium ibandronate in vitro; the most pronounced effect was observed at the concentration of 10^-5 mol/L. OCL migration and bone resorption were significantly suppressed at this concentration, though there was no effect on OCL adhesion.

Conclusions  Sodium ibandronate was effective in suppressing OCLs and decreasing resorption in GCT. The strong anti-OCL effectiveness at a high concentration in vitro indicates a topical mode of application.