凝聚态Aβ 25～35可通过JNK/p38 MAPK途径诱导胎鼠皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化

目的 探讨JNK/p38 MAPK在β淀粉样蛋白多肽片段25～35(Aβ25～35)诱导的阿尔茨海默病(AD)样胎鼠皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化中的作用.方法 应用蛋白免疫印迹和免疫细胞化学染色的方法,观察Tau蛋白磷酸化和JNK/p38丝裂原活化的蛋白激酶(JNK/p38 MAPK)的表达情况.结果 凝聚态Aβ25～35(20μmol/L)作用于皮层神经元12h,Tau蛋白Ser396、Ser199/202、Thr205位点的磷酸化水平明显增高,同时JNK/p38 MAPK的总量及其活性形式-磷酸化JNK/p38 MAPK的蛋白表达水平也增加.结论 Aβ25～35可通过激活JNK/p38 MAPK使Tau蛋白的磷酸化水平增高.     

脑内源性β-内啡肽对应激诱发促肾上腺皮质激素和催乳素释放的调节

在预先埋植第三脑室导管和预置颈外静脉导管的SD大鼠中,脑室内微量注射β-内啡肽抗血清,并与脑室内注射正常兔血清的大鼠对比。看到注射β-内啡肽抗血清后,ACTH和催乳素因限制性应激的释放,分别被抑制了46.1％和71.2％。说明中枢内源性β-内啡肽可能是ACTH和催乳素在某种应激时相伴释放的重要调节因素之一。     

丙型肝炎病毒基因分型及其与干扰素治疗应答的关系

目的为了解山西省丙型肝炎病毒的基因型和基因型对干扰素疗效的预示价值。方法用ＨＣＶ５’ＮＣ区酶切分型方法对９４例丙型肝炎病人进行基因分型，并观察其中４５例患者对干扰素α１ｂ治疗的应答。结果显示ＨＣＶⅠ组（Ⅰ、Ⅱ型）感染８０例（８５１％），ＨＣＶⅡ组（Ⅲ、Ⅳ型）感染１２例（１２８％），ＨＣＶⅠ／Ⅱ组混合感染２例（２１％）。在接受干扰素治疗的病例中，ＨＣＶⅠ组感染（３５例）的应答率为３７１％，持续应答率为１７１％，而Ⅱ组感染（１０例）的应答率为８０％，持续应答率为６０％，两组相比，有显著性差异（Ｐ＜００５，Ｐ＜００２５）。结论表明山西省以ＨＣＶⅠ组感染为主，干扰素对ＨＣＶⅡ组感染的疗效优于ＨＣＶⅠ组感染，ＨＣＶ基因型有预测干扰素疗效的意义。     

抗蓖麻毒素A链人源化单域抗体的设计、原核表达及生物活性检测

目的 运用计算机辅助蛋白质分子设计的方法设计针对蓖麻毒素A链(RTA)的拮抗肽,实现在大肠杆菌B121中的可溶性表达,并对其生物学活性进行评价.方法 根据RTA的晶体结构、RTA-rRNA相互作用复合物模型,在CVFF(consistent-valence force field)、Amber力场下,对RTA的空间构象进行理论模拟,初步确定其生物活性功能域;然后针对该功能域设计小分子拮抗肽,并借助人抗体重链町变区骨架,在CDR3区对拮抗肽进行展示,用重叠延伸PCR全基因合成人源化的单域抗体并克隆至载体pET-32a(+);双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定;IPrG诱导人源化的单域抗体表达,用镍离子亲和层析纯化,竞争ELISA和MTT法分别进行结合和中和活性检测.结果 从头搭建并设计合成了人源化的单域抗体,实现了其原核表达,并进行了牛物活性检测;建立了基于人源化的单域抗体的RTA和蓖麻毒素检测方法.结论 研究结果为新型蓖麻毒素小分子拮抗剂的研制奠定了理论和实验基础.     

CTLA-4在重症肌无力患者中的表达及其多态性导致的无效转录研究

目的 探讨重症肌无力(MG)患者细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)的表达状况及由CTLA-4基因启动区多态性导致的不同遗传易感性机制。方法 ELISA法测定MG患者血清中sCTLA-4的水平；限制性片段长度多态性分析用于检测启动区-1772、-1661位点的多态性；转录因子NF-1和c／EBPβ结合位点通过染色质免疫沉淀实验(CHIP)得以验证。结果 MG患者血清sCTLA-4的表达水平与等位基因的突变相关，携带T→C^1772突变基因的患者可表达高水平的sCTLA-4。TC^1772基因型的频率在MG患者尤其是胸腺瘤亚组明显高于对照组，而G^-1661等位基因和GG^-1661基因型的频率在MG患者则显著降低。当-1772位点的等位基因是T而非C时，存在转录因子NF-1结合位点；同样，当-1661位点的等位基因是G而非A时，存在转录因子c／EBPβ结合位点，刀豆蛋白A(Con A)、植物血凝素(PHA)能促进NF-1和c／EBPβ的这种位点特异性转录活性。结论 MG患者CTLA-4表达异常，启动区C／T^1772和A／G^-1661多态性可导致无效转录，T→C^1772的突变能影响基因的剪接，干扰蛋白的表达和功能，阻止了负性调节信号的传递而致发病。     

涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞系基因表达谱及基质金属蛋白酶表达差异

目的筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的候选基因，并对其中的候选基因进行初步的验证。方法用限制片段差异显示PCR技术（restriction fragments differential display PCR, RFDD-PCR）建立涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞株（ACC-M、ACC-2）的表达谱。对两个表达谱的片段进行比较，通过生物信息学的分析，初步筛选出候选基因。用半定量逆转录PCR技术对筛选出的基因进行初步验证。结果RFDD-PCR方法共获得5420个基因片段，其中包含12个基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）基因。半定量逆转录PCR方法发现MMP2、MMP7、MMP9、MMP14、MMP15、MMP24在ACC-M和ACC-2中的表达存在明显差异。结论构建了ACC-M和ACC-2细胞株的表达谱，为寻找目的基因奠定了基础。发现MMP2、MMP7、MMP9和MMP15与涎腺腺样囊性癌的发生、发展、转移有关，不同肿瘤细胞的转移能力可能与不同的MMPs家族基因相关。     

克隆缺失连接片段——一种基于PCR技术的缺失型假肥大型肌营养不良症的携带者检测

目的 依据dystrophin基因缺失后断端重接可形成一段变异的DNA序列,提出一种利用缺失连接片段进行缺失型假肥大型肌营养不良症携带者检测的新方法.方法 实验以来自广东省肇庆地区的一个Becker型肌营养不良(Becket muscular dystrophy,BMD)家系为研究对象,其中2例确诊的男性BMD患者,3例待诊的女性携带者,1例待诊的人工流产绒毛.先证者经外显子PCR检测确定第3～5外显子缺失,随后采用PCR步移法在相应内含子设计引物定位断裂点的位点,最后利用靠近断裂点设计的引物直接对家系的6例基因组DNA进行缺失连接片段的PCR扩增和测序.结果 6例基因组DNA均扩增出阳性的产物片段且连接片段的测序序列完全一致,绒毛的性别诊断结果为女性,可以确诊本家系中的3个女性和流产绒毛均为缺失型BMD携带者.结论 作者成功地将整个家系患者和携带者的缺失连接片段进行克隆和测序分析,实现了利用缺失连接片段对缺失型假肥大型肌营养不良症携带者进行准确基因诊断的设想,同时对在产前诊断上的应用前景进行了探讨.     

地方株HPV16L1基因免疫小鼠诱发的抗体反应

为了检测pcDNA-L1的表达，评价地方株HPV16L1基因诱导的体液免疫反应。我们采用PCR技术从宫颈癌组织中获得HPV16L1基因，以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1，进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析，再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1(-)中，构建重组pcDNA-L1，转染Cos-7细胞，通过IFA试验验证L1蛋白的表达。     

人MASP1 N端片段原核表达载体的构建及其表达

目的:在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶1(MASP1)N端片段.方法:采用PCR技术从含人MASP1 cDNA的质粒pGEM-MASP1中扩增MASP1-N端基因片段,将其插入原核表达载体pGEX4T-1,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP1-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与重组MBL-CLR、重组MBL的结合活性.结果:从pGEM-MASP1中扩增得到约860 bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4 900 bp和860 bp片段,测序结果与预期的完全一致.纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr60000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR、重组人MBL蛋白结合.结论:获得了表达人MASP1 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP1 N端片段/GST融合蛋白,为MASP1分子的进一步研究提供了条件.     

CD54和LFA-1的相互作用在6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的JurkatT细胞的黏附性增强中的作用

目的研究CD54和LFA-1的相互作用在6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的Jurkat细胞(AS)的黏附性增强中的作用。方法用细胞凝集试验确证AS细胞间黏附的增强，用细胞与细胞间黏附分子-1-人IgG的Fc片段(ICAM-1-Fc)的黏附试验和阻断性抗CD11a抗体的阻断试验研究CD54-LFA-1的作用，用单克隆抗体MEM-148检测As细胞LFA-1亲和力的变化，用单克隆抗体NKI-L16检测AS细胞LFA-1亲合力的变化，用鬼笔环肽染色细胞骨架，用Jurkat-Raji细胞间的作用作模型研究6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对T和B细胞间黏附的影响，用ConA结合试验检测细胞中蛋白质N-糖基化的变化。结果(1)AS细胞间的黏附性增强主要与CD54及CD11a表达的增强相关，也与LFA-1亲和力的增高相关；(2)AS细胞的细胞骨架发生重排；(3)As细胞与Raji细胞间的黏附也增强；(4)ConA与AS细胞的结合增强。结论CD54和LFA-1的相互作用在AS Jurkat T细胞的黏附性增强中起重要作用。细胞骨架重排也可能起作用。As细胞的蛋白质发生了N-糖基化修饰。