毕赤酵母工程菌高密度发酵肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究

目的研究重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)巴斯德毕赤酵母工程菌发酵工艺。方法首先用摇瓶对工程菌的甲醇诱导周期、甲醇浓度、pH进行研究 ,在此基础上 ,采用 5L发酵罐补料培养进行中试研究。结果人可溶性TRAIL巴斯德毕赤酵母菌在pH 6 .0、甲醇诱导浓度 1%的条件下诱导 96h ,目标蛋白质浓度最高 ,可达 72 .8mg/L。 5L发酵罐培养放大 ,可以达到 184mg/L。结论此发酵工艺可以较好地提高人可溶性TRAIL工程菌的分泌表达。     

重组人白介素18的发酵、纯化及功能鉴定

目的:利用构建的重组菌株Pichia pastoris X-33/hlL-18,在3.7L发酵罐中表达重组人自介素18(hIL-18),探讨其大规模发酵及纯化工艺.方法:复苏工程菌X-33/hIL-18于BMGY培养基,在其A600鲫达到6左右时转入发酵罐进行高密度发酵.发酵液经过滤浓缩柱、疏水层析和阴离子交换层析分离纯化.结果:工程菌在3.7 L发酵罐采用甲醇诱导补料批式发酵,在pH 6.0,溶氧值(DO)20%～30%,温度28℃,甲醇诱导48 h重组hIL-18的表达产量为202 mg/L,发酵液经纯化后纯度可达97%以上,并初步证明重组hIL-18能协同IL-2诱导PBMCs分泌IFN-γ和协同IL-2增强NK细胞的杀伤活性.结论:利用Pichia pastoris分泌型表达系统和建立的分离纯化方法,能获得大量较高纯度的重组hIL-18,为进一步研究其活性和功能奠定基础.     

卡泊芬净治疗IFI的临床研究进展

卡泊芬净为棘球白素类抗真菌药，也是第一个在全世界范围使用的棘球白素，目前已在75个国家被广泛使用。卡泊芬净可以抑制真菌细胞壁上β1，3葡聚酶的合成。在体内外均有抗假丝酵母属和曲霉属真菌的能力。其药代动力学特点允许每日1次用药，药物交叉反应很少。患耐受性好。上市5年中安全性极好。     

戊型肝炎病毒结构区OFR2基因在毕赤酵母中的分泌型表达

为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗，利用甲醇营养型酵母Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒（HEV）结构区ORF2 1．3kb基因。对构建的酵母分泌型表达载体pHIL-S1/HEV和pPIC9/HEV重组体，酶切线性化后转化入GS115酵母菌，经表型鉴定，PCR扩增筛选阳性克隆，对不同表型，不同表达载体的重组株用含甲醇的培养基诱导表达，ELISA及SDS－PAGE筛选表达活性菌株，Western-blot证实表达蛋白与HEVORF2单克隆抗体有特异性反应。得到有效表达HEVORF2蛋白的菌株并初步优化表达条件。     

密码子优化人PD-L1基因在巴斯德毕赤酵母中的表达与鉴定

目的 利用巴斯德毕赤酵母获得具有可溶性、免疫原性的重组PD-L1蛋白。方法 根据巴斯德毕赤酵母表达系统的密码子使用偏好,优化人PD-L1基因序列,将优化后的序列构建至质粒pPIC9K,合成重组质粒pPIC9K-PDL1。使用SacⅠ-HF将pPIC9K-PDL1线性化,然后通过电击法将pPIC9K-PDL1上的PD-L1基因序列整合至巴斯德毕赤酵母基因组中,依次使用MD平板(无组氨酸)和遗传霉素G418从电击处理过的菌液中筛选重组巴斯德毕赤酵母菌株,然后使用PCR和测序对筛选到的菌株进行鉴定。利用甲醇体积分数为0.005的BMMY培养基诱导重组巴斯德毕赤酵母菌株表达,使用免疫印迹法检测菌株培养基上清液中的表达产物。结果 筛选得到了稳定表达PD-L1蛋白的重组巴斯德毕赤酵母菌株,表达的PD-L1相对分子质量约为44 700,可以与抗PD-L1抗体特异性结合。结论 成功构建了稳定表达PD-L1蛋白的重组巴斯德毕赤酵母菌株,菌株表达的PD-L1蛋白可用于开发血清PD-L1检测试剂盒。     

44株酵母样真菌的药敏结果分析

近年来,由于广谱抗生素,免疫抑制剂及激素的应用,导致酵母样真菌感染日益增多,为了解我院检出酵母样真菌对抗生素的敏感情况,指导临床合理使用抗生素,有效控制酵母样真菌感染,现对我院近两年酵母样真菌的药敏结果进行分析,报告如下:     

人肝再生增强因子真核表达及其对顺铂诱导肝癌细胞凋亡的影响

目的：构建人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration,hALR）15kD亚型的真核表达系统,并探索ALR对顺铂（Cisplatin,DDP）诱导的人肝癌细胞株QGY凋亡的影响。方法：用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）方法和基因重组技术,从重组质粒pPIC9K-rhALR中扩增出编码rhALR基因片段,将其克隆入pPICZαA质粒中构建重组质粒pPICZα－A-rhALR。重组质粒SacⅠ酶切线性化后电转入酵母GS115中,并在1%的甲醇诱导下表达。表达上清蛋白经Western blot（ALR多克隆抗体和His-tag标签抗体）鉴定和镍柱亲和层析纯化。MTS试剂检测rhALR体外对人肝癌细胞（HepG2、QGY）的促增殖活性,及流式细胞仪检测rhALR在顺铂诱导QGY细胞凋亡中的抗凋亡作用。结果：PCR、双酶切、DNA测序均鉴定重组质粒构建与预期一致。分泌表达的rhALR约占上清总蛋白的70%,目的分子量约17 kD,Western blot均可见单一条带。纯化后的rhALR对HepG2和QGY的体外促增殖作用呈浓度依赖性增强（HepG2组：F=246.729,P=0.000;QGY组：F=246.004,P=0.000）,且在QGY细胞顺铂诱导凋亡时也发挥着浓度梯度式抗凋亡作用（F=101.061,P=0.000）。结论：成功构建高效分泌表达rhALR的pPICZα－A-rhALR GS115真核表达系统;体外实验证实rhALR对顺铂诱导人肝癌细胞有呈浓度依赖性的抗凋亡作用。     

实体器官移植术后真菌感染的防治

经过近70年的发展,器官移植已经成为多种终末期疾病的有效治疗手段。但器官移植受者术后需服用免疫抑制剂,导致免疫功能低下,感染的发生率较高,包括病毒、细菌和真菌感染。其中真菌感染发病较隐蔽,早期诊断较困难,假丝酵母、曲霉、隐球菌、肺孢子菌感染是实体器官移植中比较常见的真菌感染。识别实体器官移植术后真菌感染的高危因素,提前预防,术后结合1,3-β-D葡聚糖试验（真菌G试验）、影像学检查和相关体液培养结果,做到早期诊断、早期治疗,对降低实体器官移植术后真菌感染的发生率及相关的病死率具有较大的临床意义。本文就器官移植术后常见的真菌感染进行综述,以期为器官移植术后真菌感染的防治提供参考。     

白假丝酵母的耐药率变迁与抗真菌药物使用强度的相关性研究

目的：探究白假丝酵母的耐药率变迁与抗真菌药物使用强度(antibiotics use density,AUD)之间的相关性,为临床合理使用抗真菌药物提出参考。方法：抽取2013年—2018年医院住院病区收治的疑似真菌感染患者标本中分离出的白假丝酵母4 026株,分析其对常用抗真菌药物的耐药率及其变化趋势,并采用Pearson法分析白假丝酵母的耐药率与常用抗真菌药物使用强度的相关性。结果：2013年—2018年分离出4 026株白假丝酵母的药敏结果显示,其对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的耐药率为3.42%～11.18%,呈现逐年升高趋势(P<0.05);而其对5-氟胞嘧啶的耐药率低于前3种抗真菌药物;但6年间其对两性霉素B的耐药率为0.00%;白假丝酵母对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的耐药率与氟康唑的AUD呈显著正相关(r=0.908,P_0.012<0.05;r=0.939,P_0.005<0.05;r=0.838,P_0.037<0.05);对氟康唑和伊曲康唑的耐药率与卡泊芬净的AUD呈显著正相关(r=0...     

中药虎杖雌激素活性组分的分离及活性测试

药材虎杖用70%乙醇冷浸法进行提取。对虎杖中蒽醌类化合物集中分布的乙酸乙酯分配组分首先进行硅胶柱分离,得到6个组分,利用转基因酵母法测定其雌激素活性,结果表明前三个组分具有较高的雌激素活性。进一步对其中的第三个活性组分利用制备高效液相色谱进行了精制,对流出物按2分钟间隔收集,共得到20个馏分。转基因酵母法测定其雌激素活性的结果显示,在这20个馏分当中,有5个馏分具有较强的雌激素活性。分别将其雌激素活性与化学组成进行关联,发现其中的sub-fraction-13中可能存在非大黄素的雌激素活性成分。