基因重组毕赤酵母表达瑞替普酶过程中的酶活性分析

目的 研究毕赤酵母诱导表达瑞替普酶过程中的关键酶活性.方法 以摇瓶培养为研究对象,在用甲醇诱导后,连续取样,破碎菌体制成无细胞悬液,检测乙醇氧化酶、甲醛脱氢酶、PDC、G-6-PD、ID、α-KGD和SD的活性.结果 乙醇氧化酶比活在0～6 h逐渐增加,在第6h达到最大44.5 U/mg蛋白.随后迅速下降.在第24～48 h有所回升,然后又逐渐降低.FAD比活在第0～48h逐渐增加.在第48h达到最大值6.72U/mg蛋白,随后逐渐降低.直至放瓶.G-6-PD比活在第2h～6h逐渐增加,在第6～24h逐渐降低,在第24～48h逐渐升高,48h后又逐渐降低直至放瓶.PDC比活在第0～6h逐渐降低,随后略有升高的趋势.ID、α-KGD、SD的活性变化有相似趋势.在前6 h酶活均迅速下降,在第6～24 h缓慢下降,随后ID活性继续缓慢下降,而α-KGD和SD活性在第2～48 h逐渐升高,在第48 h均达到最高值,然后又逐渐降低,直至放瓶.结论 根据酶活变化规律,可将整个诱导期分为4个阶段:第1阶段为诱导0～6 h,是甲醇适应期;第Ⅱ阶段为诱导6～24h,是快速生长期;第Ⅲ阶段为诱导24～48h,是产物积累期;第Ⅳ阶段为诱导48～72h,是代谢缓慢期.在甲醇适应期,甲醇完全氧化代谢流占主导地位.在快速生长期和产物积累期,代谢流逐渐向糖酵解途径和TCA循环途径迁移.     

左甲状腺素钠联合硒酵母治疗桥本甲状腺炎合并甲状腺功能减退症的临床疗效

目的探讨左甲状腺素钠联合硒酵母治疗桥本甲状腺炎合并甲状腺功能减退症的临床疗效。方法选取郴州市第一人民医院2020年3月—2021年3月收治的桥本甲状腺炎合并甲状腺功能减退症患者100例,以随机信封分组法分为参比组(n=50)与试验组(n=50)。参比组患者予以左甲状腺素钠片治疗,试验组患者予以左甲状腺素钠片联合硒酵母片治疗。2组均连续治疗3个月。比较2组治疗前后血硒、甲状腺球蛋白抗体、甲状腺过氧化物酶抗体、甲状腺功能指标(包括促甲状腺激素、血清游离甲状腺激素、游离三碘甲状腺原氨酸),临床疗效,并观察2组不良反应发生情况。结果治疗前,2组血硒、甲状腺球蛋白抗体和甲状腺过氧化物酶抗体水平比较,差异无统计学意义(P> 0.05);治疗后,试验组血硒水平高于参比组,甲状腺球蛋白抗体和甲状腺过氧化物酶抗体水平低于参比组(P <0.05)。治疗前,2组促甲状腺激素、血清游离甲状腺激素、游离三碘甲状腺原氨酸比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,试验组促甲状腺激素低于参比组,血清游离甲状腺激素、游离三碘甲状腺原氨酸高于参比组(P <0.05)。试验组总有效率为96.0...     

鞣酸蛋白酵母散联合腹泻奶粉治疗婴幼儿腹泻的疗效观察

目的探讨鞣酸蛋白酵母散联合腹泻奶粉治疗小儿腹泻病的临床疗效。方法通过对吉林省东丰县妇幼保健医院2012年2月至2013年3月367例腹泻患儿给予鞣酸蛋白酵母散合腹泻奶粉治疗。结果 367例患儿中完全治愈345例,治愈率94.01%,显效4%,无效1.99%,总有效率98.01%。结论鞣酸蛋白酵母散联合腹泻奶粉治疗婴幼儿腹泻,能够缩短腹泻时间,提高治愈率,具有重要的临床意义。     

清咽喷雾剂对动物的清热作用

目的观察清咽喷雾剂的解热作用。方法采用内毒素致家兔发热模型和酵母致大鼠发热模型,测定给药后不同时间的体温变化,并比较组间差值。结果在内毒素致家兔发热模型试验中,清咽喷雾剂高、中剂量组在不同时段均表现出不同程度的解热作用;在酵母致大鼠发热模型解热实验中,清咽喷雾剂具有明显的解热作用。结论清咽喷雾剂对内毒素和酵母引起的两种发热动物模型均具有不同程度的解热作用。     

戊型肝炎病毒结构区OFR2基因在毕赤酵母中的分泌型表达

为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗，利用甲醇营养型酵母Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒（HEV）结构区ORF2 1．3kb基因。对构建的酵母分泌型表达载体pHIL-S1/HEV和pPIC9/HEV重组体，酶切线性化后转化入GS115酵母菌，经表型鉴定，PCR扩增筛选阳性克隆，对不同表型，不同表达载体的重组株用含甲醇的培养基诱导表达，ELISA及SDS－PAGE筛选表达活性菌株，Western-blot证实表达蛋白与HEVORF2单克隆抗体有特异性反应。得到有效表达HEVORF2蛋白的菌株并初步优化表达条件。     

影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素

巴斯德毕赤酶母表达系统是广泛使用的真核表达系统,但有些蛋白在该系统中表达量低,甚至不表达。本文从外源基因的内部结构、宿主菌、信号肽、转化子的拷贝数和发酵条件五个方面综述影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素。     

高尿酸血症动物模型研究进展

高尿酸血症发生的机制为尿酸生成增多或肾脏尿酸排泄减少。目前国内外高尿酸血症模型的复制方法主要有3种 :①给予模型动物饲喂、注射次黄嘌呤 6 0 0～ 1 0 0 0mg·kg-1 、黄嘌呤 6 0 0mg·kg-1 、腺嘌呤 1 5 0～ 30 0mg·kg-1 、酵母 1 5～ 30g·kg-1 、尿酸 2 5 0或 35 0～ 70 0mg·kg-1 ,或同时给抑制尿酸分泌的药物乙胺丁醇 2 5 0mg·kg-1 、烟酸 1 0 0mg·kg-1 均可引起体内血尿酸含量增高导致高尿酸血症。②用氧嗪酸抑制大鼠或小鼠尿酸酶活性 ,氧嗪酸钾盐 30 0mg·kg-1 一次性腹腔注射 ,可致小鼠血尿酸升高 ;大鼠饲喂氧嗪酸 0 4g·d-1和尿酸 0 6g·d-1 ,3～ 4wk后血尿酸持续性升高。③通过胚胎干细胞同源性重组 ,破坏小鼠尿酸酶基因 (EC 1 7 3 3) ,再用基因重组法获得尿酸酶缺乏的突变小鼠 ,制成高尿酸血症模型小鼠。小鼠和大鼠体内存在尿酸酶 ,可以将体内尿酸进一步分解为尿囊素 ,而禽类 (鸡、鹌鹑等 )体内缺乏尿酸酶     

诱变红酵母RY-17生物合成番茄红素的研究

文章对诱变红酵母RY-17菌株生物合成番茄红素的培养基组成和培养条件进行了初步研究,通过生长曲线的测定,各种发酵条件的优化,确定发酵培养时间,培养温度,初始pH值等参数,使菌体生物合成色素达到最大量,并采用薄层层析方法及高效液相色谱法分析确定诱变红酵母生物合成番茄红素。研究结果表明,在最优条件下,红酵母的生物量为6.92 g/100 ml、番茄红素含量为5.53 mg/L。     

人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

制备人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白.从新鲜人外周血中分离单核细胞,给予大肠杆菌脂多糖刺激后,RT-PCR制备G-CSF cDNA,以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区序列(525 bp).重叠PCR拼接HSA-GCSF融合基因(2277 bp),序列测定正确,中间未加入任何连接肽.插入表达载体pPIC9K中a交配因子的开放阅读框内,构建分泌型表达重组质粒pPIC9K-HSA-GCSF.电击转化毕赤酵母菌KM71,G418筛选得到高拷贝转化子.甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的相对分子质量约为84 k,Western blot分析融合蛋白为G-CSF与HSA的杂合分子,NFS-60细胞/MTT比色法测定融合蛋白具有G-CSF的生物学活性.结果:构建了可分泌表达HSA-GCSF融合蛋白的毕赤酵母工程菌,为进一步对其进行药学研究奠定了基础.     

毕赤酵母工程菌高密度发酵肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究

目的研究重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)巴斯德毕赤酵母工程菌发酵工艺。方法首先用摇瓶对工程菌的甲醇诱导周期、甲醇浓度、pH进行研究 ,在此基础上 ,采用 5L发酵罐补料培养进行中试研究。结果人可溶性TRAIL巴斯德毕赤酵母菌在pH 6 .0、甲醇诱导浓度 1%的条件下诱导 96h ,目标蛋白质浓度最高 ,可达 72 .8mg/L。 5L发酵罐培养放大 ,可以达到 184mg/L。结论此发酵工艺可以较好地提高人可溶性TRAIL工程菌的分泌表达。