结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用

目的观察结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10基因,构建酵母双杂交载体质粒pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,采用醋酸锂法顺序转染酵母菌AH109。结果共转染pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10的酵母菌AH109可以在SD／-Ade／-His／-Leu／-Trp培养基上生长,β-半乳糖苷酶活性实验阳性。结论结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白可以相互作用。     

赤芝FPS基因酵母单杂交文库构建及其上游转录因子的筛选

目的筛选赤芝三萜合成途径中法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因的上游调控转录因子。方法首先克隆了FPS基因启动子,并连接至pAbAi质粒构建诱饵载体pAbAi-FPS。将pAbAi-FPS转化Y1H酵母感受态细胞构建诱饵菌。采用SMART技术构建赤芝酵母单杂交cDNA文库,再将纯化的双链cDNA、pGADT7-Rec共转化诱饵菌株,筛选FPS上游的转录调控因子。结果构建了含pAbAi-FPS的诱饵载体并筛选出诱饵菌株,构建了cDNA文库并转化诱饵菌株,筛选出阳性克隆37个,得到作用FPS基因上游的转录调控因子18个,包括转录因子3个、核糖体蛋白5个及其他家族蛋白10个。结论筛选出转录因子GlSNF2、GlMHR和GlZn2Cys6为调控FPS表达的候选基因,为深入研究FPS基因的表达调控机制奠定了研究基础。     

水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.     

酵母发酵液催化不对称还原反应合成(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯的条件优化

目的:优化酵母发酵液直接催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯((S)-CHBE)的反应条件. 方法:考察酵母发酵液催化该反应过程中基质变化的规律,研究底物和能源供体对反应的影响,并通过正交实验设计法优化反应条件. 结果:在酵母发酵液催化COBE不对称还原反应的过程中,底物和还原糖消耗、产物合成相对集中在反应的前期;反复分批式添加底物和蔗糖有利于反应效率的提高;正交实验优化反应条件的结果表明:酵母发酵液直接催化COBE不对称还原反应合成(S)-CHBE的最佳反应条件为:蔗糖添加方式Ⅱ(反应开始2 h后添加5 g/120 mL),底物添加方式Ⅳ[0.5(3)],缓冲剂添加量2 g/120 mL,β-环糊精添加量为2 g/120 mL,反应后测定产物的产率达96%,ee(对映体过量值)达100%. 结论:通过反应条件优化提高了酵母发酵液的催化效果.     

SARS冠状病毒N蛋白在酵母中的表达纯化及抗原性分析

目的研究人SARS冠状病毒核壳N蛋白在Pichia pastoris酵母中的表达,获得具有生物学活性的重组N蛋白,并鉴定表达蛋白的抗原性,为下一步的研究奠定基础.方法合成引物扩增SARS冠状病毒N基因,插入含AOX1启动子的Pichiapastoris酵母表达载体中,转化酵母宿主菌KM71H、X-33、GS115,筛选阳性转化子,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达产物经镍离子柱亲和层析纯化后,以抗SARS冠状病毒N蛋白的小鼠单抗、兔多抗及SRAS病人阳性血清鉴定其抗原性.结果SDS-PAGE和免疫学分析显示,酵母转化子仅在KM71H、X-33中有Mr约70 000的诱导蛋白,表达产物具有良好的抗原性和特异性.结论在酵母表达系统中,初步实现了SARS冠状病毒核壳N蛋白的有效表达.     

hITF毕赤酵母表达载体的构建及分泌表达

目的构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体,表达重组hITF,为功能研究奠定基础.方法通过PCR获得hITFcDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pGAPZαA分泌信号下游,得到重组载体pGAPZαA-hITF.BspH I线性化后氯化锂转化进入X-33,Zeocin筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因.阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析及Western blot检测.结果经测序及PCR证实,hITFcDNA准确插入酵母表达载体pGAPZαA中,氯化锂转化后,重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中.Tricine SDS-PAGE分析证明hITF的分子量约为10×103,Western blot分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性.结论成功构建出酵母表达载体pGAPZαA-hITF,获得重组hITF,为深入研究hITF奠定了基础.     

Foxp3酵母双杂交诱饵表达载体的构建、鉴定和其毒性及自激活效应检测

目的利用酵母双杂交系统,构建人Foxp3酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其进行鉴定.方法获得正常人外周血 PBMC,抽提mRNA,通过巢式 RT-PCR 在人外周血PBMC中获得Foxp3基因片断,纯化后连接至 pMD18-T 载体,测序正确,EcoRⅠ、SalⅠ双酶切pMD18-T-Foxp3和酵母表达载体 pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为 pGBKT7-Foxp3,测序正确,用醋酸锂法将重组质粒转化酶母菌 AH109,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-Foxp3 在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能.结果 RT-PCR 扩增出的DNA 片段约1 203 bp,大小正确,与pMD18-T载体连接,测序正确.构建的诱饵载体pGBKT7-Foxp3,测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确.pGBKT7-Foxp3转化酵母感受态AH109,在SD/-Trp 板上生长良好,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落,在SD/-His/-Trp/X-α-Gal、SD/-Ade /-Trp/X-α-Gal平板上不能生长,说明AH109[pGBKT7-Foxp3]转化成功,对酵母菌株AH109不具有毒性且不具自主激活报告基因的功能.结论成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-Foxp3,可作为酵母双杂合系统中的"诱饵", 为下一步利用酵母双杂交系统筛选Foxp3相互作用蛋白创造了条件.     

应用酵母双杂交系统筛选FGFR3相互作用的蛋白质

目的通过酵母双杂交系统从小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库中筛选与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)相互作用的蛋白质,为研究FGFR3信号通路提供新的线索.方法构建FGFR3胞内区的真核表达载体R3-PI,转化酵母菌AH109.毒性实验及自激活实验证实FGFR3胞内区蛋白对酵母细胞无毒性,不存在自激活现象.将小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库转入AH109/R3-PI酵母菌中,能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质.结果通过初步筛选得到3种能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用.结论通过筛选发现CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用,提示FGFR3可能通过CLK4参与能量代谢调节,而CLK4可能通过对FGFR3的磷酸化或去磷酸化调节FGFR3的活性.     

芪玉三龙汤调节Beclin1,Atg5,LC3B表达以抑制肺癌肿瘤生长机制

目的:研究芪玉三龙汤对肺癌小鼠皮下移植瘤生长及对自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin1),自噬相关基因5(autophagy related genes,Atg5)及微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1light chain3,LC3B)表达的影响。方法:采用Lewis肺癌细胞(lewis lung cancer cell,LLC)构建肺癌移植瘤小鼠模型,造模成功后随机分为模型组、芪玉三龙汤组、顺铂组及联合组,每组18只移植瘤小鼠。模型组每日按照生理盐水20 mL·kg~(-1)灌胃;芪玉三龙汤组每日按照80. 48 g·kg~(-1)灌胃;顺铂组在第1,3,5天腹腔注射顺铂溶液(DDP)0. 4 mL;联合组每日按80. 48 g·kg~(-1)灌胃给药,并分别在第1,3,5天腹腔注射顺铂溶液0. 4 mL;连续治疗21 d剥离瘤组织,称取瘤重,计算抑瘤率。苏木素-伊红(HE)染色观察肿瘤组织形态学改变。免疫组化检测肿瘤组织中Beclin1,LC3B蛋白表达和定位。蛋白免疫印迹法(Western blot)测定Beclin1,Atg5,微管相关蛋白1轻链3-I(LC3B-Ⅰ)及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)蛋白表达,并计算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肿瘤组织Beclin1,Atg5 mRNA转录水平。结果:芪玉三龙汤具有温和的移植瘤抑制作用,抑瘤率为31. 2%;镜下观察芪玉三龙汤组肿瘤组织可见片状坏死的肿瘤细胞;免疫组化及Western blot实验表明,与模型组比较,芪玉三龙汤能够上调Beclin1,Atg5,LC3B蛋白的表达(P 0. 01),并且能促进LC3B-Ⅰ转化为LC3B-Ⅱ;Real-time PCR结果表明,与模型组比较,芪玉三龙汤能够促进Beclin1,Atg5 mRNA的转录(P 0. 01)。结论:芪玉三龙汤对肺肿瘤生长具有温和地抑制作用,其作用机制可能与上调自噬关键分子Beclin1,Atg5,LC3B表达,促进LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ转化有关。     

新型冠状病毒重组蛋白疫苗的构建、表达及鉴定

目的 利用毕赤酵母系统表达重组新型冠状病毒受体结构域蛋白RBD,以期作为新冠病毒重组蛋白候选疫苗。方法 选择新型冠状病毒的RBD(受体结合域)蛋白为靶点,通过基因工程技术将RBD基因序列克隆到毕赤氏酵母表达载体pPIC9K中。通过载体将外源基因整合到毕赤酵母染色体上,获得遗传性稳定重组子。毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列,加入甲醇进行诱导,通过前导信号肽引导外源蛋白的分泌表达。结果 成功将RBD基因序列克隆到表达载体中并整合到酵母染色体上,获得遗传性稳定重组子。能通过前导信号肽引导目的蛋白的分泌表达,表达产物免疫动物刺激产生高水平的血清IgG抗体,IgG抗体效价为1∶2.73×10⁶。结论 重组新型冠状病毒受体结构域蛋白RBD的设计具有可行性,为重组蛋白候选疫苗在预防新型冠状病毒感染中具有潜在的应用价值。