灵芝锰过氧化物酶毕赤酵母工程菌培养条件的优化

目的 研究毕赤酵母生产重组灵芝锰过氧化物酶(recombinant Ganoderma lucidum manganese peroxidase,rG1MnP)的最优培养条件.方法 在单因素实验基础上,采用中心组合设计和响应曲面法对rGlMnP工程酵母产rGlMnP的发酵条件进行优化,探讨初始pH、温度、甲醇浓度和血红素浓度对重组毕赤酵母生产的rGlMnP的酶活力的影响,分析上述4个因子的交互作用及其最佳水平范围,并验证模型的有效性.结果 初始pH、温度、甲醇浓度和血红素浓度对毕赤酵母生产rGlMnP的酶活力有显著影响;毕赤酵母生产rGlMnP最优的培养条件为:初始pH5.5、诱导温度30℃、甲醇浓度1.5％以及血红素浓度1.0 mmol/L.结论 本研究为利用毕赤酵母工程菌大规模生产rGlMnP奠定了基础.     

侵袭性感染白假丝酵母ERG11突变分析与氟康唑耐药关系研究

目的明确医院侵袭性感染的白假丝酵母氟康唑耐药的主要分子机制及其与ERG11突变的关系,以指导临床抗真菌的治疗。方法收集2015年1月-2017年6月医院临床住院患者分离的50株侵袭性感染白假丝酵母,采用VITEK-2COMPACT进行检测及药敏分析,提取其真菌基因组DNA,采用PCR检测ERG11基因并测序分析,同时采用实时荧光定量RT-PCR检测ERG11基因mRNA相对表达量,并采用SPSS19.0统计软件分析氟康唑耐药与ERG11突变及相对表达量之间关系。结果 50株侵袭性白假丝酵母主要来自尿液、伤口分泌物和腹水标本,其中对氟康唑耐药11株,氟康唑剂量依赖性耐药10株,氟康唑敏感29株;ERG11基因扩增及测序分析发现15个突变位点,其中11个为同义突变,无氨基酸改变,4个为错义突变;白假丝酵母氟康唑耐药株、剂量依赖性敏感株和氟康唑敏感菌株ERG11基因的mRNA表达水平之间比较差异有统计学意义(F=78.30,P=0.002);随着白假丝酵母对氟康唑敏感性的降低,ERG11基因mRNA的表达量均有不同程度的上升。结论侵袭性感染白假丝酵母氟康唑耐药严重,耐药水平与ERG11基因的错义突变及表达量密切相关。     

硒酵母联合左旋甲状腺素治疗淋巴细胞性甲状腺炎的临床效果观察

目的:探讨硒酵母联合左旋甲状腺素治疗淋巴细胞性甲状腺炎的临床效果观察.方法:将2015年2月～2017年2月在我院就诊的84例淋巴细胞性甲状腺炎患者随机分为两组,对照组采用左旋甲状腺素治疗,观察组采用硒酵母联合左旋甲状腺素治疗,比较两组临床疗效、甲状腺激素水平、机体免疫情况.结果:观察组临床有效率为95.24％,较对照组的78.57％明显上升,两组有显著差异(P<0.05);观察组治疗后FT3、FT4、TSH、TPOAb、TGAb与对照组相比明显改善,两组有显著差异(P<0.05);观察组治疗后CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK细胞较对照组明显改善,两组有显著差异(P<0.05).结论:硒酵母联合左旋甲状腺素治疗淋巴细胞性甲状腺炎具有良好效果,积极改善甲状腺激素水平,促进恢复正常,减少抗体,增加外周T细胞,增强免疫,具有临床意义.     

乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70在毕赤酵母中的融合表达

目的构建乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70（Mycobacterium tuberculosis heat shock protein70，Mt．hsp70）基因融合表达载体，并研究其在巴斯德毕赤酵母中的表达情况，为改善发展新的乙脑疫苗打基础。方法以酵母表达载体pPICZa-A为基本单位构建E蛋白基因主要抗原片段与hsp70的融合表达载体，融合基因以酶切位点BamHⅠ连接，用电穿孔法转化酵母X-33，用Zeocin平板筛选重组子，经甲醇诱导表达后，SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果E蛋白基因与hsp70的融合表达载体构建成功，SDS-PAGE显示，其相对分子质量为114kD，与实际大小相符，经凝胶薄层扫描分析，表达量为33mg／L，经Western印迹验证，有良好的抗原性。结论E—hsp70融合蛋白在酵母中的表达为下一步研究hsp70是否能作为E蛋白免疫时的理想佐剂作准备。     

毕赤酵母重组猪囊尾蚴抗原cC1的特征研究

目的 研究毕赤酵母重组猪囊尾蚴抗原cC1蛋白的特征变化。方法 对表达产物行SDS—PAGE,FPLC离子交换层析和分子筛，等电聚焦，脱磷酸反应，N端氨基酸测序，小鼠免疫接种。结果 毕赤酵母重组猪囊尾蚴抗原cC1蛋白的分子量较原核的大，易于纯化，等电点较理论值低，重组cC1已被磷酸化，N端携带了来自载体的4个氨基酸，免疫原性较原核的明显增强。结论 毕赤酵母重组猪囊尾蚴抗原cC1蛋白的特征较原核的有了明显变化，尤其是蛋白易于纯化及免疫原性的增强，表明毕赤酵母表达系统非常适合重组亚单位疫苗的生产制备。     

水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.     

酵母发酵液催化不对称还原反应合成(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯的条件优化

目的:优化酵母发酵液直接催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯((S)-CHBE)的反应条件. 方法:考察酵母发酵液催化该反应过程中基质变化的规律,研究底物和能源供体对反应的影响,并通过正交实验设计法优化反应条件. 结果:在酵母发酵液催化COBE不对称还原反应的过程中,底物和还原糖消耗、产物合成相对集中在反应的前期;反复分批式添加底物和蔗糖有利于反应效率的提高;正交实验优化反应条件的结果表明:酵母发酵液直接催化COBE不对称还原反应合成(S)-CHBE的最佳反应条件为:蔗糖添加方式Ⅱ(反应开始2 h后添加5 g/120 mL),底物添加方式Ⅳ[0.5(3)],缓冲剂添加量2 g/120 mL,β-环糊精添加量为2 g/120 mL,反应后测定产物的产率达96%,ee(对映体过量值)达100%. 结论:通过反应条件优化提高了酵母发酵液的催化效果.     

SARS冠状病毒N蛋白在酵母中的表达纯化及抗原性分析

目的研究人SARS冠状病毒核壳N蛋白在Pichia pastoris酵母中的表达,获得具有生物学活性的重组N蛋白,并鉴定表达蛋白的抗原性,为下一步的研究奠定基础.方法合成引物扩增SARS冠状病毒N基因,插入含AOX1启动子的Pichiapastoris酵母表达载体中,转化酵母宿主菌KM71H、X-33、GS115,筛选阳性转化子,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达产物经镍离子柱亲和层析纯化后,以抗SARS冠状病毒N蛋白的小鼠单抗、兔多抗及SRAS病人阳性血清鉴定其抗原性.结果SDS-PAGE和免疫学分析显示,酵母转化子仅在KM71H、X-33中有Mr约70 000的诱导蛋白,表达产物具有良好的抗原性和特异性.结论在酵母表达系统中,初步实现了SARS冠状病毒核壳N蛋白的有效表达.     

hITF毕赤酵母表达载体的构建及分泌表达

目的构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体,表达重组hITF,为功能研究奠定基础.方法通过PCR获得hITFcDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pGAPZαA分泌信号下游,得到重组载体pGAPZαA-hITF.BspH I线性化后氯化锂转化进入X-33,Zeocin筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因.阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析及Western blot检测.结果经测序及PCR证实,hITFcDNA准确插入酵母表达载体pGAPZαA中,氯化锂转化后,重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中.Tricine SDS-PAGE分析证明hITF的分子量约为10×103,Western blot分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性.结论成功构建出酵母表达载体pGAPZαA-hITF,获得重组hITF,为深入研究hITF奠定了基础.     

应用酵母双杂交系统筛选FGFR3相互作用的蛋白质

目的通过酵母双杂交系统从小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库中筛选与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)相互作用的蛋白质,为研究FGFR3信号通路提供新的线索.方法构建FGFR3胞内区的真核表达载体R3-PI,转化酵母菌AH109.毒性实验及自激活实验证实FGFR3胞内区蛋白对酵母细胞无毒性,不存在自激活现象.将小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库转入AH109/R3-PI酵母菌中,能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质.结果通过初步筛选得到3种能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用.结论通过筛选发现CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用,提示FGFR3可能通过CLK4参与能量代谢调节,而CLK4可能通过对FGFR3的磷酸化或去磷酸化调节FGFR3的活性.