烟台市手足口病合并脑炎病毒分离及基因序列分析

目的 了解烟台地区手足口病合并脑炎病原谱及其基因学特征.方法 采集烟台地区手足口病合并脑炎患者粪便及脑脊液标本,通过细胞培养分离病毒,实时荧光PCR鉴定病毒型别,RT-PCR扩增VP1区基因部分序列并测序,进行序列分析.结果 10份粪便标本分离病毒3株,均为EV71.与C4a型代表株核苷酸同源性为98％～99％,氨基酸同源性98.90％～99.45％.系统发生树中,烟台分离株与C4亚型C4a簇代表株位于同一分支.结论 烟台地区手足口病合并脑炎病原主要为EV71,属于C4亚型C4a簇.     

EV71结构蛋白VP1的原核表达及VP1单克隆抗体的制备

目的:原核表达EV71结构蛋白VP1并制备其单克隆抗体。方法:以肠道病毒71型(EV71)P1基因为模板,设计引物扩增出目的片段VP1,将其连接至大肠杆菌表达载体pET-32a(+)上,转化大肠杆菌TG1,筛选出阳性克隆后进行测序。将重组表达载体pET-32a(+)-VP1转化大肠杆菌表达菌株BLgold(DE3),对该工程菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,表达产物以包涵体的形式存在。包涵体用6 mol/L盐酸胍溶解,经过Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白。用纯化的VP1蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体(mAb)。结果:获得了24株mAb,其中1株EV71 Westernblot法鉴定呈阳性,5株EV71间接免疫荧光法(IFA)鉴定阳性。结论:成功地制备了VP1的mAb。     

自噬与凋亡在肠道病毒感染细胞过程中的影响及其相互作用CSCD

肠道病毒感染可引起一些严重的疾病,如脊髓灰质炎病毒感染导致急性弛缓性麻痹、柯萨奇病毒感染导致病毒性心肌炎和无菌性脑膜炎等、埃可病毒感染引起发热和无菌性脑膜炎等、肠道病毒71型感染导致心肺功能障碍和神经系统疾病等.近年来越来越多的研究发现,细胞自噬与凋亡在肠道病毒感染过程中有重要作用.本文就自噬和凋亡在肠道病毒感染过程中的影响及二者的相互作用进行综述.     

肠道病毒71型感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的miRNA表达谱

目的 研究肠道病毒71型(EV71)感染神经细胞的miRNA表达谱,探讨miRNA在病毒感染神经细胞中的可能作用.方法 建立EV71感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)模型,收集感染后48 h细胞.以Taqman低密度芯片检测miRNA表达谱,使用实时RT-PCR对芯片结果进行验证并在TargetScan和miRanda网站预测靶基因,采用GO和KEGG分析靶基因功能.结果 成功建立EV71感染SH-SY5Y细胞模型,通过低密度芯片筛选出215种显著升高的miRNA和25种显著下调的miRNA.经过RT-PCR验证,3种miRNA(MiR-10a*、miR-15b*和miR-195)显著下调,7种miRNA(miR-10a、miR-342-5p、miR-483-5p、Let-7b、miR-99a、miR-140-5p和miR-21)显著上调,与芯片结果相符.GO分析显示发展进程和信号调节条目最富集靶基因.KEGG路径分析显示靶基因在肿瘤路径、蛋白水解、Wnt信号传导、黑素形成、粘附连接、MAPK信号通道最富集.结论 EV71感染神经细胞48 h后miRNA表达谱发生改变,10种变化的miRNA靶基因预测在发展进程、信号传导及凋亡中起着重要的作用,可为后期机制研究提供参考.     

肠道病毒-D68 VP1蛋白原核表达、纯化及抗原性的评价

目的 原核表达EV-D68结构蛋白VP1,并对其抗原性进行评价.方法 以肠道病毒68型P1基因为模板,设计引物扩增出目的片段VP1,将其连接至大肠杆菌表达载体pGEX-5X-1上.将重组表达载体pGEX-5X-1-VP1转化大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)pLysS,对该工程菌进行诱导表达.菌体裂解后用SDS-PAGE电泳、Western-blot鉴定融合蛋白;对表达菌体进行超声破碎和亲和层析纯化;使用酶联免疫吸附试验方法评估目的蛋白与不同种属EV-D68阳性血清的结合能力及亲和力.结果 成功构建融合表达载体pGEX-5X-1-VP1,经过双酶切及测序鉴定均正确;成功表达和纯化出EV-D68(En-terovirus D68,EV-D68)VP1融合蛋白,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,得到与预期蛋白相对分子质量为61000大小一致的目的条带;纯化蛋白与不同种属的阳性血清可以特异性结合,与兔血清、恒河猴血清、小鼠血清的亲和力常数分别为1.6×106、3.9×105、3.1×106.结论 成功表达了EV-D68 VP1融合蛋白,为研究EV-D68 VP1蛋白的结构、功能及中和抗体筛选奠定基础.     

人肠道病毒71型感染免疫抑制恒河猴的分析

目的: 通过建立人肠道病毒71型(EV71)感染在免疫抑制恒河猴的动物模型,进一步分析人EV71在免疫抑制动物体内病毒增殖、病理变化以及病毒抗原在不同组织的表达情况。方法: 按照每天15 mg/kg的剂量给8只恒河猴口服环孢菌素A连续7 d后造成其免疫抑制状态,再经呼吸道和消化道感染EV71病毒FY23株,对其进行14 d的临床观察后处死,采集各器官组织进行病毒载量检测,同时对不同的组织进行病理学分析和免疫组化分析。结果: 感染EV71病毒后,免疫抑制组的临床症状、病毒载量、病理分析和免疫组化结果都明显比非免疫抑制组严重,从病毒对机体造成的影响来看呼吸系统感染较消化系统感染明显严重。结论: 本实验分析了人EV71在免疫抑制动物体内病毒增殖的情况,为建立用于EV71疫苗评价的恒河猴动物模型提供了依据,并对未来的EV71疫苗的使用人群范围做出了新的限定。     

深圳地区肠道病毒71型VP1基因变异趋势研究

目的 研究深圳地区肠道病毒71型VP1基因变异趋势.方法 用肠道病毒71型特异性引物进行RT-PCR,并对EV71的VP1进行扩增,所得的序列与肠道病毒71型A、B、C基因型代表株的核苷酸序列比较,用DNA Star、BioEdit和Mega 3.1软件进行系统进化分析.结果 35株病毒间VP1核苷酸同源性为92.1%-100%,它们与A、B基因型代表株VP1区核苷酸同源性差异较大,为81.4%-91.1%,与C4基因型代表株接近,其核苷酸同源性在93%-97.4%之间.1998-2004年深圳地区EV71主要流行株为C4b亚型,从2003年开始逐步向C4a亚型过渡,至2006年已全部变迁为C4a亚型,且从2003年至2008年,深圳地区EV71 C4a株与安徽阜阳株FY23的核苷酸的同源性分别为：94.5%-94.7%,95.7%-95.8%,96.2%,95.4%-97.5%,96.3%-99.2%,有逐年增高的趋势.2006年两株EV71和2008年EV71代表株核苷酸序列在VP1区的第66位点,均由A→C,从而导致VP1区氨基酸的第22位点由谷酰胺变为组氨酸（Q→H）.结论 深圳地区EV71流行株逐渐由C4b亚型向C4a亚型演变,2006年部分EV71及2008年EV71 VP1第66核苷酸位点发生有义突变.     

人肠道病毒71型VPO蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VPO蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性.方法:PCR方法扩增VPO基因,构建原核表达质粒pET-VPO并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VPO重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VPO多克隆抗体,ELISA方法检测抗VPO抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性.结果:VPO重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VPO抗体效价为1:106.细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VPO多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VPO蛋白.结论:原核表达了EV71的VPO蛋白并制备出抗VPO多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段.     

广州市2008-2011年手足口病流行特征动态研究

目的分析2008年5月至2011年7月广州市手足口病的流行病学特征,以了解流行现状,探讨流行趋势,为制定有效的防控策略奠定基础。方法采用描述性流行病学方法分析2008-2011年广州市手足口病疫情资料的流行特征。手足口病的肛拭子标本从哨点医院获得,采用RT-PCR方法进行病毒核酸检测。结果疫情暴发月份提前,流行强度增大,高位持续时间延长;市区病例构成从2008年下半年的48.32%逐步降至2011年上半年的35.09%,农村地区则从2008年的11.95%逐步升至24.67%,城乡结合部相对稳定在40.30%左右;病例主要在5岁以下婴幼儿,但呈现出低龄化、成人化的两极化发展趋势,男性高于女性;散居儿童病例数构成比从2008年下半年的60.04%增至2011年的68.92%,托幼儿童则从2008年的38.09%降至2011年的28.27%,学生病例2009年以来相对稳定在2.55%左右;肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）呈现交替流行的现象。结论广州市手足口病疫情不断向低龄儿童、散居儿童和农村地区扩散,同时不同型别的毒株交替出现。手足口病疫情形势严峻,防控难度加大。     

2009年夏季174例手足口病患儿病原分析

目的分析本院2009年夏季手足口病患儿病原及其血清型特征,为临床早期诊断和疾病防控提供实验依据。方法2009年4—9月,首都儿科研究所附属儿童医院门诊就诊的174例手足口病患儿咽拭子和疱疹液,实时荧光RT—PCR方法检测肠道病毒通用型（EV）、柯萨奇A16型（CA16）、肠道病毒71型（EV71）。131例患儿双份血清,同时检测CA16、EV71IgM抗体。CA16和EV71阳性标本扩增VP1区基因片段后测序,进行同源性和系统进化分析。结果（1）EV、CA16、EV71阳性例数分别为167、112、46;阳性率为96．O％、64．4％、26．4％,CA16：EV71为2．43：1。（2）首诊血清CA16和EV71IgM阳性例数为51、25,阳性率为38．9％、19．1％,复诊阳性例数为98、32,阳性率为74．8％、24．4％。（3）CA16VP1区核苷酸同源性为88．7％-98．5％,EV71VP1区核苷酸同源性为94．9％-99．7％,与c4亚型参比序列核苷酸同源性92．1％～95．3％。结论2009年夏季本院手足口病患儿病原以CA16、EV71为主,EV71阳性率较之前报道有较大幅度升高。EV71病毒株以c4亚型为主。实时RT-PCR法较血清学检测特异性IgM抗体更适于疾病早期诊断。