BMP信号通路在华法林诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)信号通路在华法林诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化中的作用。方法体外分离培养大鼠胸主动脉VSMC,将其随机分为正常对照组、高磷组、华法林(10μmol/L)干预组及华法林(10μmol/L)+维生素K(10μmol/L)干预组。对细胞进行钙含量和碱性磷酸酶(ALP)活性检测,茜素红染色检测钙结节,Western blot检测细胞中Runx2蛋白的表达变化,RT-PCR检测细胞中骨形态发生蛋白2(BMP-2)、Smad1及Runx2的表达变化。结果茜素红染色结果显示,与正常对照组和高磷组相比,华法林干预组钙化结节明显增多;钙含量测定结果与茜素红染色结果基本一致。与正常对照组和高磷组相比,华法林干预组ALP活性明显增加(P0.05),Runx2 mRNA和蛋白表达水平及BMP-2、Smad1 mRNA表达明显增高(P0.05);与华法林干预组相比,华法林+维生素K干预组细胞钙含量、ALP活性及BMP-2、Smad1、Runx2的表达均明显降低(P0.05)。结论BMP信号通路参与了华法林促进的大鼠VSMC钙化,其可能的作用机制是介导了VSMC的表型转化。     

4,4’-二异硫氰基茋-2,2’-二磺酸对高糖诱导心肌细胞损伤的保护作用

目的：探讨高糖诱导心肌细胞损伤过程中氯离子浓度的变化以及氯离子通道阻断剂4,4’-二异硫氰基茋-2,2’-二磺酸（DIDS）对受损心肌细胞的作用。方法原代培养乳鼠心肌细胞,应用葡萄糖浓度为33mmol/L DMEM培养基,作用72h,构建心肌细胞损伤模型。实验分为对照组、高糖组、高糖＋DIDS组和DIDS组。用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,氯离子荧光探针（MQAE）检测细胞内氯离子浓度。结果高糖作用下的心肌细胞存活率呈浓度及时间依赖性降低（P＜0.05）,流式细胞仪检测显示受损心肌细胞以凋亡性损伤为主。MQAE检测结果显示,与对照组比较,高糖组细胞内氯离子浓度显著下降（P＜0.05）。心肌细胞存活率及细胞内氯离子浓度,DIDS组与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。与高糖组比较,高糖＋DIDS组心肌细胞存活率显著升高,细胞内氯离子浓度下降明显减少,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论氯离子通道参与了高糖诱导的心肌细胞损伤过程,DIDS可在一定程度上减轻以凋亡为主的心肌细胞损伤。     

辛伐他汀对平滑肌祖细胞分化、增殖、迁移及黏附能力的影响

目的：观察辛伐他汀对骨髓源性平滑肌祖细胞（SPC ）分化及增殖的影响,筛选新一代包被洗脱支架药物。方法：采用密度梯度离心法从大鼠骨髓获取单个核细胞,接种于纤维连接素包被的培养板,培养8d后,以平滑肌肌动蛋白（α-SM A ）免疫荧光染色鉴定骨髓源性SPC ,并在倒置荧光显微镜下计数。收集培养8d单个核细胞、贴壁细胞,分别加入不同浓度辛伐他汀（0.01-10μmol/L ）培养8d、24h。分别采用氚标记胸苷（3 H-TdR）摄入法、改良的Boyden小室和黏附能力测定实验观察SPC的分化、增殖、迁移和黏附能力。结果：与对照组（无辛伐他汀干预）相比,0.01μmol/L辛伐他汀显著抑制骨髓单个核细胞向SPC分化[（85±4）个比（79±5）个]、增殖[（4070±184）个比（3833±126）个]、迁移[（44±3）个比（39±3）个]和黏附[（59±5）个比（52±4）个], P均＜0.05,且随辛伐他汀浓度增加S PC数量显著减少（ P＜0.01）。结论：辛伐他汀可抑制骨髓源性平滑肌祖细胞分化、增殖、迁移及黏附能力。     

右美托咪定对心室肌细胞L型钙通道电流的影响

目的观察右美托咪定(DEX)对大鼠心室肌细胞L型钙离子通道电流(ICa-L)的影响,探讨其对心脏电活动影响的机制。方法取SD大鼠,用酶解法分离获得单个心室肌细胞,采用全细胞膜片钳技术记录ICa-L,观察不同浓度的DEX(0.6,1.8,5.4,10,200 ng/ml)以及1μmol/L育亨宾(α2肾上腺素受体拮抗剂)单独使用及与10 ng/ml DEX联合使用对ICa-L的影响。结果 0.6,1.8,5.4,10,200 ng/ml的DEX对峰电流的抑制率分别为8.8%±2.4%、14.6%±3.6%、21.4%±8.4%、25.2%±6.4%和32.1%±6.6%,使I-V曲线上移。小剂量(0.6,1.8,5.4 ng/ml)的DEX对ICa-L激活曲线无明显影响(n=6,P>0.05);大剂量(10和200 ng/ml)的DEX可使ICa-L激活曲线右移。0.6,1.8,5.4,10,200 ng/ml的DEX可使ICa-L失活后恢复时间延长。10 ng/ml的DEX可使ICa-L的峰值抑制约25.2%±6.4%,再向电极外液中加入育亨宾后ICa-L平均增加约15%(n=6,P<0.05)。1μmol/L育亨宾灌流前后ICa-L的峰值无差异(n=6,P>0.05)。结论 DEX对心室肌细胞ICa-L具有浓度依赖性地抑制作用,可能是通过细胞膜上的α2肾上腺素受体介导的。     

微小RNA-182通过靶基因Rac1调控高糖诱导的心肌细胞肥大

目的 探讨微小RNA(miR)-182调控高糖诱导的心肌细胞肥大的机制.方法 利用生物信息学方法预测调控Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)的候选miR.在糖尿病组小鼠(db/db小鼠)和对照组小鼠(db/m小鼠)心肌组织中验证所有候选miR的表达,并分别与Rac1 mRNA做Pearson相关性分析.体外实验,将原代培养的乳鼠心肌细胞分为对照组(葡萄糖浓5 mmol/L)和高糖组(葡萄糖浓度33 mmol/L,HG组).光镜下观察各组乳鼠心肌细胞的形态学变化.采用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组乳鼠心肌细胞中miR-182和Rac1 mRNA表达水平.再将原代乳鼠心肌细胞分为4组,分别为正常糖组(葡萄糖浓度5 mmol/L,对照组)、高糖组(葡萄糖浓度33mmol/L,HG组)、正常糖+miR-182模拟物组(miR-182组)和高糖+miR-182模拟物组(HG+ miR-182组).采用Lipofectamine2000转染miR-182模拟物(终浓度为100 nmol/L).分别采用RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测乳鼠心肌细胞中Rac1、β-肌球蛋白重链(β-MHC)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白表达水平.结果 生物信息学方法预测到参与调控Rac1的候选miR共6个,分别为miR-182、miR-142-3p、miR-140、miR-101a、miR-429和miR-200b.糖尿病组小鼠心肌组织中miR-182和miR-142-3pmRNA表达水平均明显低于对照组(P均＜0.05),且miR-182、miR-142-3p mRNA均与Rac1 mRNA表达水平呈负相关(相关系数分别为r=-0.89102,r=-0.837 19),miR-182与Rac1负相关性最为显著.体外实验结果显示HG组乳鼠心肌细胞中miR-182 mRNA表达水平明显低于对照组(P＜0.05),Rac1 mRNA表达水平则明显高于对照组(P＜0.05);光镜下观察HG+ miR-182组乳鼠心肌细胞肥大程度轻于HG组;HG+ miR-182组乳鼠心肌细胞Rac1和β-MHC mRNA及蛋白表达水平均明显高于HG组(P均＜0.05).结论 miR-182可能通过其靶基因Rac1对高糖诱导的心肌细胞肥大进行调控.     

脱细胞血管基质与血管平滑肌细胞的体外相容性

目的：酶-化学除垢剂制备脱细胞血管基质，检测其与平滑肌细胞的相容性，探讨其作为组织工程支架材料的可行性。 方法：实验于2003-12／2005-12在哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心完成。①脱细胞血管基质制备：在37℃水浴振荡条件下，犬总动脉先后用1g/L胰蛋白酶＋0．2g/L乙二胺四乙酸钠和1．0％Triton X-100进行脱细胞处理24h和176h，充分漂洗，冷冻干燥后备用。②平滑肌细胞的提取：应用组织块贴壁法体外培养扩增犬隐静脉的平滑肌细胞。③四甲基偶氮唑盐法测定脱细胞血管基质浸提液对平滑肌细胞的毒性：设浸提原液、75％、50％和25％浸提液组，阴性对照组（DMEM＋体积分数为0．1的胎牛血清培养液）。以阴性对照组的吸光度作为100％细胞增殖率，增殖百分率（P％）=[实验组A值／阴性对照组A值]&;#215;100％，按ISO和医学生物材料标准评定材料毒性。④急性毒性试验：取成年大鼠8只，将备用脱细胞血管基质研磨成粉末，生理盐水配成2g/L的混悬液，无菌条件下向大鼠腹腔内注入1mL脱细胞血管基质混悬液，观察72h，记录动物有无死亡及不良反应。⑤亚急性毒性试验：取成年大鼠12只，随机分成2组。实验组用脱细胞血管基质混悬液灌胃，剂量为500mg／kg质量，隔日1次，共10次；对照组给等量生理盐水灌胃。实验期间观察记录体质量变化及动物活动情况。21d取血检查血常规。⑥溶血试验：取抗凝兔血8mL，加入生理盐水10mL，稀释备用。取脱细胞血管基质粉末，加生理盐水中，再加入稀释兔血离心后取上清测定545nm处的吸光度。阴性对照为生理盐水10mL加入稀释兔血；阳性对照为蒸馏水加入稀释兔血。溶血率=[（试验材料的吸光度-阴性对照的吸光度）／（阳性对照的吸光度-阴性对照的吸光度）1&;#215;100％。⑦凝血试验：血库健康献血员新鲜血浆，用自动血液凝固测定仪进行凝血酶原凝固试验、测定部分凝血活酶凝固时间、凝血酶凝固时间和纤维蛋白原。取血浆2mL加入脱细胞血管基质粉100mg，混合后再测定上述指标。 结果：①酶-化学除垢剂能使犬总动脉细胞几乎完全脱落，使基质纤维的三维结构变得疏松。苏木精-伊红、胶原染色和弹力纤维染色显示脱细胞血管基质无细胞残留，主要成分为胶原和弹力纤维。②动物实验表明材料无急性、亚急性毒性。体外实验脱细胞血管基质的溶血率为1．6％，符合医用生物材料生物性能测试所提出的溶血率〈5％标准。材料混合前后，血浆中凝血酶原凝固试验、部分凝血活酶时间、凝血酶凝固时间和纤维蛋白原4项指标检测结果无明显变化，说明材料不引起凝血功能的改变。③四甲基偶氮唑盐显示75％脱细胞血管基质浸提液培养平滑肌细胞1，3和5d后，细胞增殖率均大于95％，材料毒性为0或1级。 结论：Triton X-100和胰蛋白酶制备的脱细胞基质具有良好的生物相容性，能与异体犬平滑肌细胞结合到一起，并在体外生成血管移植物。     

脱细胞血管基质与血管平滑肌细胞的体外相容性

目的:酶-化学除垢剂制备脱细胞血管基质,检测其与平滑肌细胞的相容性,探讨其作为组织工程支架材料的可行性。方法:实验于2003-12/2005-12在哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心完成。①脱细胞血管基质制备:在37℃水浴振荡条件下,犬总动脉先后用1g/L胰蛋白酶 0.2g/L乙二胺四乙酸钠和1.0%TritonX-100进行脱细胞处理24h和176h,充分漂洗,冷冻干燥后备用。②平滑肌细胞的提取:应用组织块贴壁法体外培养扩增犬隐静脉的平滑肌细胞。③四甲基偶氮唑盐法测定脱细胞血管基质浸提液对平滑肌细胞的毒性:设浸提原液、75%、50%和25%浸提液组,阴性对照组(DMEM 体积分数为0.1的胎牛血清培养液)。以阴性对照组的吸光度作为100%细胞增殖率,增殖百分率(P%)=犤实验组A值/阴性对照组A值犦×100%,按ISO和医学生物材料标准评定材料毒性。④急性毒性试验:取成年大鼠8只,将备用脱细胞血管基质研磨成粉末,生理盐水配成2g/L的混悬液,无菌条件下向大鼠腹腔内注入1mL脱细胞血管基质混悬液,观察72h,记录动物有无死亡及不良反应。⑤亚急性毒性试验:取成年大鼠12只,随机分成2组。实验组用脱细胞血管基质混悬液灌胃,剂量为500mg/kg质量,隔日1次,共10次;对照组给等量生理盐水灌胃。实验期间观察记录体质量变化及动物活动情况。21d取血检查血常规。⑥溶血试验:取抗凝兔血8mL,加入生理盐水10mL,稀释备用。取脱细胞血管基质粉末,加生理盐水中,再加入稀释兔血离心后取上清测定545nm处的吸光度。阴性对照为生理盐水10mL加入稀释兔血;阳性对照为蒸馏水加入稀释兔血。溶血率=犤(试验材料的吸光度-阴性对照的吸光度)/(阳性对照的吸光度-阴性对照的吸光度)犦×100%。⑦凝血试验:血库健康献血员新鲜血浆,用自动血液凝固测定仪进行凝血酶原凝固试验、测定部分凝血活酶凝固时间、凝血酶凝固时间和纤维蛋白原。取血浆2mL加入脱细胞血管基质粉100mg,混合后再测定上述指标。结果:①酶-化学除垢剂能使犬总动脉细胞几乎完全脱落,使基质纤维的三维结构变得疏松。苏木精-伊红、胶原染色和弹力纤维染色显示脱细胞血管基质无细胞残留,主要成分为胶原和弹力纤维。②动物实验表明材料无急性、亚急性毒性。体外实验脱细胞血管基质的溶血率为1.6%,符合医用生物材料生物性能测试所提出的溶血率<5%标准。材料混合前后,血浆中凝血酶原凝固试验、部分凝血活酶时间、凝血酶凝固时间和纤维蛋白原4项指标检测结果无明显变化,说明材料不引起凝血功能的改变。③四甲基偶氮唑盐显示75%脱细胞血管基质浸提液培养平滑肌细胞1,3和5d后,细胞增殖率均大于95%,材料毒性为0或1级。结论:TritonX-100和胰蛋白酶制备的脱细胞基质具有良好的生物相容性,能与异体犬平滑肌细胞结合到一起,并在体外生成血管移植物。     

非钙依赖性调节肌球蛋白活性对维持平滑肌张力的影响

目的：揭示肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)的一个活性片段对肌球蛋白功能的非钙依赖性调节作用，进一步完善平滑肌收缩的非钙依赖性调节机制研究，并为平滑肌系统疾病的治疗以及新药开发提供理论基础。方法：实验于2004-01／05在大连医科大学生化药理实验室完成。用胰蛋白酶(trypsin)水解MLCK，再经离子交换层析分离纯化而获得MLCK的活性片段(myosin light chain kinase fragment,MLCKF.61 ku)；用western blot检测MLCKF与完整MLCK的同源性：用SDS—PAGE及Scoin lmage扫描软件检测肌球蛋白轻链的磷酸化程度；用分光光度法测定肌球蛋白Mg^2 —ATP酶的活性。结果：在无Ca^2 ／CaM条件下，61 ku MLCKF能轻度磷酸化20ku肌球蛋白轻链，并提高肌球蛋白Mg^2 -ATP酶活性；其磷酸化效力强于无Ca^2 ／CaM时MLCK的磷酸化效力．但弱于有Ca^2 ／CaM时MLCK的磷酸化效力，且持续时间长，较稳定，不易被MLCK抑制剂ML-9抑制结论：MLCKF能以非钙依赖性方式轻度磷酸化肌球蛋白轻链．并提高肌球蛋白Mg^2 -ATP酶活性，对低钙时平滑肌张力的维持可能起一定作用。     

足阳明经穴针刺对家兔离体胃窦平滑肌细胞舒缩活动与胞内三磷酸肌醇含量的影响

目的：探讨针刺血清足三里、天枢、梁门等足阳明经穴针刺血清对家兔离体胃窦平滑肌细胞舒缩活动及胞内三磷酸肌醇含量的影响.方法：实验于2003-07/12在广州中医药大学和广州中医药大学附属第二医院完成.将45只家兔随机分为5组,每组9只.生理盐水组：耳缘静脉滴注0.9%氯化钠溶液剂量为10 mL/kg;阿托品模型组：耳缘静脉滴注以生理盐水配制的2.5 mg/100 mL的阿托品;足阳明经穴组、足少阳经穴组、足太阳经穴组均先静滴阿托品（滴注方法同阿托品模型组）,在滴完阿托品总量的一半时,开始分别电针双侧足阳明经穴（足三里、天枢、梁门、四白）、足少阳经穴（阳陵泉、带脉、日月、阳白）、足太阳经穴（承筋、背下点、背上点、攒竹）30 min,待电针完毕后,颈动脉采血6 mL离心15 min,取上清,制备成“针刺血清”.另取家兔10只,手术取胃,分离胃窦平滑肌,经Ⅱ型胶原酶消化后制备胃窦平滑肌细胞悬液,以“针刺血清”与家兔胃窦平滑肌细胞作用,用戊二醛固定后测定细胞长度和细胞内三磷酸肌醇含量.结果：进入细胞长度分析的家兔为43只,进入三磷酸肌醇含量分析家兔为45只.[1]细胞长度比较：足阳明经穴组明显低于足少阳经穴组[（42.05&;#177;7.85,77.33&;#177;9.80）μm,（P＜0.01）];足太阳经穴组明显高于生理盐水组[（75.88&;#177;9.14,64.58&;#177;6.59）μm,（P＜0.05）].[2]三磷酸肌醇含量比较：足少阳经穴组明显低于组阳明经穴组[（33.15&;#177;7.45,48.96&;#177;8.89）pmol/10^6,（P＜0.01）];阿托品模型组明显低于生理盐水组[（31.65&;#177;7.69,40.84&;#177;9.82）pmol/10^6,（P＜0.05）].结论：足阳明经穴针刺血清能使离体胃窦平滑肌细胞产生明显的收缩效应,其收缩效应的产生与升高细胞内的三磷酸肌醇含量有关.     

牵张刺激对乳大鼠心房肌细胞瞬时外向钾电流和内向整流钾电流的影响

 目的：探究牵张刺激对乳鼠心房肌细胞瞬时外向钾电流（Ito）、内向整流钾电流（IK1）和动作电位时程（APD）的影响。方法：取1日龄SD乳大鼠心脏,分离、消化获得心房肌细胞。于细胞牵引装置培养24 h分组：对照组不予牵张刺激;牵张组予增加12%硅胶膜面积牵张刺激24 h。膜片钳全细胞记录方法记录细胞膜Ito、IK1和APD的变化。结果：在+60 mV刺激电压水平,牵张组Ito密度与对照组相比明显降低［(16±04）pA/pF vs (121±29) pA/pF,P<001］。在-120 mV刺激电压下,牵张组IK1密度较对照组增大［（-108± 08） pA/pF vs (-88±09)pA/pF,P<001］。牵张组动作电位复极50%（APD50）和复极90％（APD90）均较对照组明显缩短［(105±14）ms vs (155±24) ms,(300± 28) ms vs (563±36) ms,P<001］。结论：牵张刺激可降低乳大鼠心房肌细胞Ito密度,增大IK1密度,缩短APD,这可能是压力负荷增大致心房电重构的基础之一。