肌浆网Ca^2﹢-ATP酶在柔红霉素致大鼠心肌损伤中的作用

目的：探讨柔红霉素（ DNR）致大鼠心肌损伤的作用机制。方法用随机数字表法将健康清洁的SD大鼠分为DNR组和对照组,每组20只。DNR组腹腔注射DNR 3.5 mg/kg,对照组腹腔注射等容积0.9%氯化钠注射液,均每周1次,连续4周。注射DNR或0.9%氯化钠注射液1、3和4周末2组分别各取5只大鼠进行心电图、心肌组织肌浆网Ca^2﹢-ATP酶（ SERCA2a）蛋白表达及组织病理学检测。结果腹腔注射DNR可成功复制亚急性心肌损伤大鼠模型。实验第2周时DNR组大鼠出现精神差、活动缓慢、嗜睡、进食减少等症状,对照组大鼠活动、体重、进食均正常;第4周大鼠心电图QRS波电压下降＆gt;30%,ST段抬高,P波尖耸,心肌组织病理学检查显示心肌细胞胞质浑浊,有空泡形成,肌纤维排列紊乱,间隔增宽。实验1周时2组大鼠心肌组织SERCA2a蛋白表达均呈中等阳性,而实验3及4周末DNR组大鼠心肌组织SERCA2a蛋白表达均呈弱阳性。实验3及4周末,DNR组大鼠SERCA2a蛋白表达阳性细胞数明显低于同时点对照组大鼠[（42.2±1.2）个比（65.30±1.6）个,（35.2±6.0）个比（66.7±1.5）个,均P﹤0.05]。结论 DNR可抑制大鼠心肌组织SERCA2a蛋白表达,可能是其心肌毒性的机制之一。     

rAAV1-SERCA2a转导对慢性心力衰竭beagle犬的治疗作用

目的 研究重组1型腺相关病毒(rAAV1)介导的肌质网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)基因转导对慢性心力衰竭(HF)beagle犬的治疗作用及町能的机制. 方法 经快速右心室起搏建立beagle犬的慢性HF模型.16只beagle犬分为4组:对照组(n=4),HF组(n=4),HF+EGFP组(n=4)和HF+SERA2a组(n=4).应用开胸心肌内注射术,分别将携带EGFP基因rAAW1和携带SERCA2a基因rAAV1导人HF+EGFP组和HF+SERCA2a组的beagle犬心肌,剂量为1×10 12/ml,而对照组和HF组未进行任何处理.基因转导后30d,应用超声心动图、血流动力学检测各组beagle犬的心脏收缩和舒张功能、Westem blotting检测SERCA2a蛋白表达水平,TUNEL法检测心肌细胞的凋亡指数,免疫组织化学染色检测Bax的表达. 结果 在基因转导后30d,HF+SERCA2a组SERCA2a蛋白表达水平较HF组明显增加,随着SERCA2a表达增加心功能也得到改善,左室收缩压峰值(LVSP)、左室舒张末压(IVEDP)、左室内压最大上升速率(LV+dp/dtmax)和左室内压最大下降速率(LV-dp/max)均接近对照组水平,较HF组明显改善(P＜0.05).SERCA2a基因治疗后心肌细胞凋亡指数、Bax表达比HF组显著降低(P＜0.05). 结论 SERCA2a基因转导能够治疗慢性心力衰竭,改善心功能,抑制心肌细胞凋亡.     

Duchenne型肌营养不良症肌肉超微病理研究

目的:观察Duchenne型肌营养不良症(DMD)患者病变肌肉超微病理特征,从亚细胞水平上探讨其发病机制。方法:对临床确诊的7例DMD患者,通过肌肉活检进行超薄切片和冷冻复型透射电镜观察。结果:超薄切片电镜观察显示:(1)肌原纤维"Z"线模糊不清,肌原纤维过收缩、肌丝排列紊乱等变性、坏死。(2)肌纤维内线粒体空泡样变;糖原累积;肌浆网有程度不等的病变。(3)间质毛细血管内皮细胞肿胀、闭塞,血流瘀滞。冷冻复型电镜观察显示:粗细肌丝排列紊乱,膜蛋白颗粒大小不等的变化。结论:DMD时,肌细胞膜结构缺陷除可导致肌纤维变性、坏死外,还可致线粒体、糖原、肌浆网及肌原纤维板层体膜内颗粒等一系列亚细胞水平的变化;另外,血液循环障碍可导致肌细胞继发变性、坏死,推测在本病的发病中也起着重要作用。     

U83836E对原代大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制研究

目的:观察U83836E对原代大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用并探讨其初步机制.方法:分离大鼠原代心肌细胞建立缺氧复氧(H/R)模型,细胞随机分为5组,观察不同剂量U83836E对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用.结果:与Control组比较,H/R组心肌细胞内钙离子浓度明显增高,肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA2)表达显著减少.与H/R组比较,U83836E干预各组心肌细胞内游离钙离子浓度明显降低,且肌浆网钙泵的蛋白表达上调.结论:U83836E对缺氧复氧心肌细胞有保护作用,其可能与上调SERCA2的表达抑制细胞内钙超载有关.     

姜黄素抗家兔慢性心力衰竭的机制研究

目的：观察姜黄素对家兔慢性心力衰竭的治疗作用并探讨其机制.方法：采用主动脉瓣返流联合腹主动脉缩窄制作慢性心力衰竭家兔模型,心衰和假手术动物均进一步分为姜黄素组和安慰剂组.10wk后行超声心动图测定心动能的指标,检测左室心肌肌浆网Ca^2＋-ATP酶的表达水平.结果：与假手术组相比,心衰组、心衰姜黄素组左室内径增大、室壁增厚,射血功能、心肌肌浆网Ca^2＋-ATP酶的表达水平降低（P〈0.05）;与心衰组相比,心衰姜黄素组左室内径、室壁厚度较小,射血分数、心肌肌浆网Ca^2＋-ATP酶的表达水平较高（P〈0.05）.结论：姜黄素可改善兔慢性心力衰竭模型的心功能,其机制可能与增加肌浆网Ca^2＋-ATP酶的表达有关.     

钙离子ATP酶2a基因修饰骨髓间充质干细胞移植改善慢性心力衰竭大鼠的心功能***☆

背景：目前仍缺乏有效手段修复心力衰竭后受损心肌，逆转心肌病理性重塑。作为一种新的治疗策略，用正常肌细胞和治疗性基因干预受损心肌正逐渐显示出其在改善心功能方面的优势。 目的：观察腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的有效性和稳定性。并以携带肌浆网钙离子ATP酶（sarcoplasmic reticulum Ca(2+) ATPase，SERCA2a) 基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞，治疗心力衰竭大鼠，比较SERCA2a基因治疗，骨髓间充质干细胞移植以及骨髓干细胞基础的SERCA2a基因治疗慢性心力衰竭大鼠的效果。 设计：随机对照实验。 单位：解放军总医院老年心血管病科和北京医科大学生物化学系。 材料：选取购于北京医科大学动物实验中心的4周龄雄性SD大鼠作为骨髓供体。选取体质量200~250 g雌性成年SD大鼠作为细胞移植和基因治疗受体。以雄性大鼠Y染色体sry基因鉴定供体移植细胞是否在雌性大鼠受体心肌内存活。实验所用Ad-SERCa2a，Ad-EGFP的构建由我科鲁小春博士完成；第3和8代骨髓间充质干细胞自行分离培养。 方法：实验于2004-07/2005-12在北京医科大学生物化学系周春燕实验室完成。对30只雌性SD大鼠进行左冠状动脉结扎，制作急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠模型。将造模成功的29只大鼠随机分为4组：基因治疗组7只，干细胞移植治疗组7只，基因修饰的干细胞移植组8只，腺病毒空载体对照组7只，分别予以单纯SERCA2a基因、MSC移植、SERCA2a基因修饰的骨髓间充质干细胞移植及腺病毒空载体干预。分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，用携带SERCA2a及绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-SERCA2a-GFP）转染第3和8代骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：采用流式细胞仪检测不同代骨髓间充质干细胞的Ad-SERCA2a-GFP转染率。分别在治疗前及治疗后14，21 d采用超声心动图检测大鼠心功能。采用免疫组化法检测大鼠心脏Ⅷ因子表达；采用RT-PCR 和Western杂交检测SERCA2a的基因和蛋白水平表达，并按照说明书检测宿主SERCA2a功能活性。 结果：①转染率：腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的转染率超过80%，第3代骨髓间充质干细胞与第8代的转染率比较，差异无显著性意义（P > 0.05）。②大鼠心功能：治疗后14 d，与腺病毒空载体对照组相比，其余3组左室射血分数均明显升高（P < 0.01）。治疗后 21 d，与腺病毒空载体对照组相比，干细胞移植治疗组和基因修饰的干细胞移植组大鼠室壁增厚；干细胞移植治疗组和基因修饰的干细胞移植组左室射血分数和左室短轴缩短率改善率持续升高（P < 0.01），基因治疗组两指标改善率较治疗14 d时下降。与腺病毒空载体对照组相比，基因修饰的干细胞移植组左室前壁和室间隔收缩期纵向峰值速度显著升高（P < 0.01），左室前壁和室间隔舒张期纵向峰值速度亦呈现相同改善(P < 0.01)。③心肌SERCA2a的基因、蛋白水平表达和功能活性，以及Ⅷ因子表达：携带SERCA2a基因的骨髓干细胞在宿主心肌能有效地合成和表达有功能的SERCA2a蛋白。与腺病毒空载体对照组相比，基因修饰的干细胞移植组SERCA2a基因、蛋白表达和酶活性均显著增强。干细胞移植组心力衰竭大鼠心脏瘢痕区可观察到Ⅷ因子表达。 结论：①第3和8代骨髓间充质干细胞均具有高腺病毒转染率，骨髓间充质干细胞是基因治疗的良好细胞载体，其介导的SERCA2a基因治疗对衰竭心肌具有持续稳定的心功能改善作用。②骨髓间充质干细胞移植改善心功能的作用可能与促进血管新生有关。     

内皮素受体拮抗剂CPU0213对异丙肾上腺素心肌病SERCA2a表达的改善作用

目的：研究异丙肾上腺素心肌病模型心肌细胞肌浆网钙ATP酶（sarco-endoplasmic reticulum ATPase 2a,SERCA2a）表达的改变,以及新型内皮素受体拮抗剂CPU0213的治疗作用。方法：雄性SD大鼠皮下给予异丙肾上腺素（2mg·kg^-1·d^-1）10d,治疗组动物在第6到第10天皮下给予CPU0213（30mg·kg^-1·d^-1）。各组动物颈动脉插管记录心功能指标：左心室收缩压（LVSP）,左心室舒张末期压（LVEDP）,和左心室压力变化最大速率（±dp/dtmax）。左心室心肌组织SERCA2a的mRNA及蛋白表达分别用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blotting）测定。结果：异丙肾上腺素引起左心室收缩和舒张功能明显下降,同时SERCA2a的mRNA及蛋白表达均显著下调（P〈0.05）。CPU0213显著提高SERCA2a表达（P〈0.05）,明显改善心功能（P〈0.05）。结论：CPU0213可通过逆转肌浆网钙调控蛋白SERCA2a的表达下调,使异丙肾上腺素引起的心功能下降得以恢复。本实验证明SERCA2a是β受体过度激活引发心衰过程中的重要靶点。内皮素受体介导了β受体过度激活状态下SER-CA2a的表达下调,是内皮素受体拮抗剂治疗心衰的重要依据之一。     

肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌RyR结合特性及基因C-末端序列的研究

目的分析肺动脉高压时肺动脉平滑肌Ryanodine受体(ryanodine receptor,RyR)的结合功能改变及基因序列的变化。方法梯度离心法提取肺动脉平滑肌肌浆网膜蛋白组分,放射配基结合方法测定平衡解离常数(Kd)、最大结合容量(Bmax)的变化;体外提取肺动脉平滑肌细胞总RNA,反转录合成RyR2cDNA,以cDNA为模板使用特异性引物对目的片段进行PCR扩增,切胶回收后Sanger双脱氧末端终止法测定序列。结果野百合碱(monocrotaline,MCT)所致肺动脉高压组RyR最大结合容量(Bmax)为(197±21.4)nmol.g-1protein,较对照组(168±13.7)nmol·g-1protein明显增加(P<0.01);平衡解离常数(Kd)为(0.276±0.026)nmol·L-1与对照组(0.282±0.031)nmol·L-1相比差异无显著性(P>0.05);野百合组RyR2C-末端基因序列与对照组无差异。结论MCT所致肺动脉高压大鼠RyR最大结合容量(Bmax)增加,提示受体的数量发生了上调;Kd无明显变化,说明与受体的亲和力无改变。MCT所致肺动脉高压大鼠2型RyR(RyR2)C-末端基因序列无变化。     

糖尿病大鼠心肌钠钙交换蛋白与肌浆网钙泵mRNA表达水平的研究

目的探讨糖尿病大鼠心肌病变是否与钠钙交换蛋白Ⅰ亚型(NCX1)及肌浆网钙泵2a亚型(SERCA2a)表达水平变化有关。方法大鼠腹腔注射链佐霉素制备实验性糖尿病大鼠模型。将大鼠成模后分别于4w、6w和8w时取心肌组织,进行病理学检查及计算心脏相对重量观察心肌病变程度;应用RT-PCR方法扩增NCX1和SERCA2a两种产物,计算NCX1与SERCA2amRNA相对数量的变化,并与相应周数的正常对照组进行比较。结果糖尿病各组心脏湿重与体重的比值均明显高于对照组,病理检查显示心肌细胞呈不同程度变性坏死;4w,6w糖尿病组NCX1和SERCA2amRNA的量有所降低,但无统计学差别,而8w时,糖尿病组NCX1和SERCA2amRNA相对含量比对照组明显减少(P<0.05)。结论在糖尿病合并心肌病变时,大鼠心肌的NCX1与SERCA2a的mRNA水平降低,提示其心脏功能的减退与NCX1和SER-CA2a的mRNA水平降低有一定关系。     

心肌肌浆网Ca~(2+)-ATP酶研究进展

在正常心肌舒张期,心肌肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)将Ca2+从胞质中摄回肌浆网中,在心肌肥厚、心力衰竭等病理生理过程中有多条信号通路对SERCA2a进行调节,使其活性和表达量下调。通过转基因及药物治疗上调SERCA2a的表达,可能会成为心力衰竭等疾病治疗的新手段。