全文获取类型
收费全文 | 2528篇 |
免费 | 127篇 |
国内免费 | 256篇 |
专业分类
耳鼻咽喉 | 22篇 |
儿科学 | 11篇 |
妇产科学 | 9篇 |
基础医学 | 400篇 |
口腔科学 | 170篇 |
临床医学 | 226篇 |
内科学 | 267篇 |
皮肤病学 | 7篇 |
神经病学 | 61篇 |
特种医学 | 82篇 |
外国民族医学 | 2篇 |
外科学 | 143篇 |
综合类 | 1024篇 |
预防医学 | 112篇 |
眼科学 | 29篇 |
药学 | 156篇 |
6篇 | |
中国医学 | 48篇 |
肿瘤学 | 136篇 |
出版年
2024年 | 11篇 |
2023年 | 41篇 |
2022年 | 50篇 |
2021年 | 60篇 |
2020年 | 48篇 |
2019年 | 48篇 |
2018年 | 24篇 |
2017年 | 27篇 |
2016年 | 63篇 |
2015年 | 55篇 |
2014年 | 122篇 |
2013年 | 118篇 |
2012年 | 199篇 |
2011年 | 265篇 |
2010年 | 219篇 |
2009年 | 239篇 |
2008年 | 303篇 |
2007年 | 207篇 |
2006年 | 187篇 |
2005年 | 173篇 |
2004年 | 125篇 |
2003年 | 64篇 |
2002年 | 57篇 |
2001年 | 45篇 |
2000年 | 33篇 |
1999年 | 31篇 |
1998年 | 18篇 |
1997年 | 17篇 |
1996年 | 20篇 |
1995年 | 10篇 |
1994年 | 8篇 |
1993年 | 5篇 |
1992年 | 5篇 |
1991年 | 3篇 |
1990年 | 6篇 |
1989年 | 1篇 |
1988年 | 2篇 |
1987年 | 1篇 |
1985年 | 1篇 |
排序方式: 共有2911条查询结果,搜索用时 0 毫秒
41.
将商品化真核表达载体pcDNA3改造成T载体pcDNA3-T,并运用pcDNA3-T直接克隆了由PCR扩增的adw2亚型乙肝病毒preS2与S基因。结果:pcDNA3-T与PCR产物的重组率高达70%。提示:该方法具有简便,省时等特点。 相似文献
42.
目的:构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体,为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法:以小鼠脾脏总RNA为模板,以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA;另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白(GFP)基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP,测序鉴定正确后,用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞(HEK293细胞),荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果:成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP,并在HEK293细胞中实现表达。结论:小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功,为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。 相似文献
43.
人载脂蛋白Eε3等位基因的克隆及表达 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:克隆人载脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)ε3等位基因,测定序列,并构建带有人源性APOEε3等位基因的真核表达载体.方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人胎儿脑组织中克隆得到APOEε3等位基因,与PMD19-T载体连接,再酶切PMDl9-T-APOE ε3,获得APOEε3基因,然后将其与表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-N1-APOEε3真核表达载体.重组质粒转染293T细胞后,在荧光显微镜下观察EGFP的表达,并用Western-Blot的方法检测目的蛋白在293T细胞中的表达.结果:经酶切和DNA测序证明APOEε3基冈序列正确,真核表达载体构建成功.将重组质粒转染293T细胞,在转染后的细胞中检测到目的蛋白的表达.结论:成功构建了pEGFP-N1-APOEε3真核表达载体,该表达载体能在真核细胞中正确表达. 相似文献
44.
目的:构建人mir-216a真核表达载体,实现其在胃癌细胞SGC7901/DDP中的表达,为进一步研究mir-216a的功能打下基础.方法:依据miRBase数据库中pre-mir-216a序列设计引物;PCR扩增pre-mir-216a基因并将其克隆至pGenesil-1载体;将pGenesil-1-hsa-mir-... 相似文献
45.
目的 从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段并克隆到pIRES2-EGFP,构建miR-22的真核表达载体.方法 利用PCR技术从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段,克隆到质粒pUCm-T,测序正确后构建到真核表达载体pIRES2-EGFP中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行序列测定.脂质体Lipofectamin 2000法转染Hela细胞后G418筛选获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过RT-PCR方法对neo片段进行鉴定,采用Northern blot技术检测miR-22的表达.结果 PCR扩增得到的334 bp片段与预期的miR-22前体对应的基因组片段序列一致;成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/miR-22,测序结果正确.重组质粒转染Hela细胞后,经G418筛选成功获得阳性克隆.Northern blot分析显示miR-22在Hela细胞内高效表达.结论 本实验成功克隆了miR-22的前体对应的基因组片段,构建其真核表达载体,并在Hela细胞内获得高表达,为深入研究微小RNA miR-22的功能奠定了基础. 相似文献
46.
目的 构建登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达质粒.方法 RT-PCR扩增NSI-NS2a基因片段后,将其克隆人真核表达载体pReceiver-M01a;过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光染色鉴定重组质粒.结果 经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pRe-NS1-NS2a;重组质粒转染Vero细胞后,间接免疫荧光染色显示细胞质中有登革2型病毒特异性蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pRe·NS1-NS2a. 相似文献
47.
目的 建立体外phPPARα-IRES2-EGFP质粒高效转染并获得重组基因hPPARα高效表达的体系.方法 采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将phPPARα-IRES2-EGFP转染入293细胞,荧光显微镜观察质粒转染的293细胞绿色荧光蛋白(GFP)报告基因表达强度及转染效率,并对转染细胞hPPARα的表达进行荧光定量PCR和Western Blot检测.结果 荧光显微镜下可见转染phPPARα-IRES2-EGFP的293细胞GFP报告基因高表达,转染效率高达(83±9)%;并且,其hPPARα mRNA表达水平高于空载体转染对照组3个数量级,hPPARα蛋白表达也远高于对照组(P<0.01),说明导入的重组质粒能够高效表达bPPARα.结论 成功建立重组质粒phPPARα-IRES2-EGFP高效体外转染表达体系,为hPPARα受体功能的研究及基于hPPARα为靶标的药物筛选平台的建立奠定了基础. 相似文献
48.
目的 构建小鼠成纤维细胞生长因子受体1/巨噬细胞炎性蛋白3a-Fc融合基因(FGFR1/MIP3a-Fc)的真核表达质粒,并在293T细胞中的表达。方法 设计合成FGFR1/MIP3a融合基因引物,用PCR方法扩增获得FGFR1/MIP3a基因片段,用内切酶消化后插入pc DNA3.1(+)/Fc(Mouse Ig G2a)质粒中,构建FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒;经PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定后,将该融合基因表达质粒瞬时转染293T细胞,用ELISA法检测其在293T细胞的表达。结果 经PCR、酶切鉴定以及测序证实,FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功;ELISA检测FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒能够在293T细胞中表达。结论 FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功,该质粒能够在293T细胞中表达。 相似文献
49.
目的:为了探讨Rap2c基因与肺癌发生的关系,克隆人Ras家族小G蛋白Rap2c的cDNA,构建其真核表达质粒并在人肺癌细胞株A549和H1299中表达。方法人骨肉瘤细胞株U2OS提取细胞总RNA,经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)逆转录成cDNA,PCR扩增Rap2c,酶切后插入pcDNA3.1(+)构建真核表达质粒 pcD-NA3.1(+)-Rap2c,采用酶切及测序鉴定。重组质粒转染A 549和H 1299细胞,Western blot 检测其目的基因表达。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA3.1(+)-Rap2c成功构建,Werstern blot 检测到 A549和H 1299细胞有相应蛋白表达。结论成功构建人Rap2c基因真核表达质粒,为后续研究奠定了基础。 相似文献
50.
目的 将人源ZAK-β基因定向克隆入MSCV-IRES-GFP质粒,构建真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β.方法 以肺癌A549细胞的cDNA为模板,通过PCR得到ZAK-β特异性基因产物,克隆入真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,获得重组真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β,测序验证.结果 扩增了ZAK-β基因,经双酶切、测序鉴定证实目的基因克隆到真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,测序结果与预测完全一致.结论 成功构建了ZAK-β逆转录病毒表达载体,为进一步研究ZAK蛋白激酶的功能奠定了基础. 相似文献