登革病毒Taqman双重荧光PCR分型研究

目的建立鉴定登革病毒型别的双重实时Taqman PCR反应体系,以准确快速鉴定登革病毒型别。方法根据GenBank上已发表的登革病毒四个型别的全基因序列,进行对比分析,分别设计登革病毒的四个型别引物和探针,登革I、III型探针用FAM-TAMARA标记,登革II、IV型探针用JOE-TAMARA标记。经过条件优化后,建立检测登革病毒I/II型和III/IV型的两套双重实时荧光RT-PCR方法,扩增四型登革病毒RNA、登革病毒阴性样本和登革病毒RNA稀释样本,检测方法的特异性、重复性和检测限性。结果通过设计筛选序列和优化反应条件,建立登革病毒I、II型和登革病毒III、IV型的双重荧光PCR反应体系,通过试验证明,所建立的方法具有良好的特异性、重复性和检测限性,能准确快速地对登革病毒进行分型。结论建立了一种快速双重荧光PCR方法能同时对登革病毒进行分型和鉴定。     

2018年广州市输入型登革病毒3型基因组全序列测定和特征分析

目的 分析广州市2018年输入型登革热病毒3型（DENV - III）毒生物学来源,为本地登革热防控提供科学依据和基线数据。方法 通过传染病监测网络收集广州市2018年输入型DENV - Ⅲ病例,对患者急性期血清进行病毒分离培养、全基因组测序、系统发生树重建和生物信息学分析。结果 共分离到4株DENV - Ⅲ型毒株,株间核苷酸（氨基酸）同源性为91.8%～97.3%（97.6%～99.4%）;泰国输入的分离株属于G - I型,与印度尼西亚2016年分离株的距离最近;其余3株分离株属于G - Ⅲ型,在进化树上处于同一分支,分别与老挝、巴基斯坦和新加坡分离株的距离最近;经过比对,4株分离株和13株参考株的E蛋白区域有18个氨基酸位点出现替换,NS1蛋白区域有7个氨基酸位点出现替换,NS5蛋白区域有21个氨基酸位点出现替换。结论 广州市2018年输入型DENV - Ⅲ毒株分属于2个不同的基因型亚群,在进化上距离较远,抗原性差异较大;通过全基因组测序和特征分析,逐步完善周边地区的病毒特征信息,为防控工作提供生物学溯源依据,具有重要意义。     

2016年-2018年浙江省义乌市输入1型登革病毒分子溯源分析

目的对2016年-2018年义乌市输入1型登革热病例进行实验室检测与分子溯源分析。方法采集登革热病例急性期血清标本进行NS1抗原和核酸检测,用RT-PCR法扩增包膜蛋白(Envelope protein,E)基因,测定核苷酸序列并进行系统进化分析。结果6例登革热病例NS1抗原和核酸检测结果均为阳性。6株毒株之间的E基因核苷酸和氨基酸同源性分别为96.6%~99.3%和98.8%~100%,系统进化分析显示,E基因序列均属于登革病毒1型的GⅠ亚型,与东南亚2003年-2016年分离病毒株亲缘关系最近。结论2016年-2018年义乌市输入登革病毒1型的亚型主要为GⅠ亚型,输入来源主要为东南亚国家。     

Th细胞及其细胞因子与登革病毒致病机制关系的研究进展

近年来 ,登革病毒所致疾病病例不断增加 ,虽有诸多学者致力于对其致病机制的研究 ,但至今仍未完全明了。Th细胞亚群及其细胞因子与登革病毒所致疾病的重要关系引起许多学者的兴趣 ,本文试就近年来这方面的研究进展作一综述     

登革Ⅱ型病毒对淋巴细胞和骨髓细胞SCE率影响的实验研究

报道３０例离体培养的人体外周血淋巴细胞及２０例离体培养的正常人骨髓细胞加入登革Ⅱ型病毒前后的ＳＣＥ率改变，结果表明：登革Ⅱ型病毒可以提高外周血淋巴细胞及骨髓细胞的ＳＣＥ率，说明该病毒对人体这两类细胞的染色体均具有损伤作用。实验还观察到不同个体的淋巴细胞及骨髓细胞在加入登革Ⅱ型病毒后，其ＳＣＥ率的升高有个体差异，说明了染色体或ＤＮＡ损伤程度不等。     

广州地区白纹伊蚊体内登革病毒的检测

目的了解广州地区登革热传播媒介白纹伊蚊携带登革病毒的情况，为登革热预防控制提供预测预警信息。方法从广州11个行政区及其登革热旧疫点捕获白纹伊蚊成蚊和幼虫（经实验室培育羽化成成蚊），提取登革病毒RNA，One step SYBR Green I实时RT-PCR进行检测。结果2005—2007年从广州地区采集的493批白纹伊蚊（6255只）中，共检测出两份阳性结果，分别来自登革热疫点和旧疫点，经测序证实为登革I型．其余为阴性。最低感染率为0．32。结论本文白纹伊蚊携带登革病毒比率较低，可能与登革病毒在蚊体内传代的递减效应、采样时间滞后以及广州登革热非连续性爆发有关。     

Ⅰ型登革病毒NS1抗原捕获ELISA的建立和初步临床诊断应用

目的以登革病毒特异性非结构蛋白1（NS1）单克隆抗体为基础建立Ⅰ型登革病毒（DEN1）抗原检测的酶联免疫吸附（ELISA）法，并探索从病人早期血清样品中检测DEN1-NS1的可行性。方法利用已制备的抗DEN1-NS1单克隆抗体（单抗），进行多种抗体组合配对优化模式的分析，建立双抗体夹心抗原捕获ELISA，以469份健康人血清样品确定cut off值，检测DEN1感染患者急性期血清样品。结果对多种抗体组合反复筛选，最终确立了最佳的包被单抗和酶标测定单抗，建立了抗体夹心捕获DEN1-NS1抗原的酶联免疫测定方法，能特异检测DEN1，与其他血清型登革病毒不发生交叉反应。检测16例临床确诊DEN1感染病人急性期血清样品，15例呈特异的抗原反应阳性。结论成功建立了DEN1-NS1抗原捕获ELISA并应用于临床血清样品的检测，为登革热的早期实验室诊断提供技术方法。     

天然罗汉松二萜体外抗登革病毒活性研究

登革病毒(dengue virus,DENV)是造成热带和亚热带地区登革热和登革出血热季节性大爆发的蚊媒病原体,可导致严重威胁生命的疾病,因此亟需研发DENV疫苗和药物。本研究发现从石栗枝叶中分离的罗汉松型二萜(3α,5β,10α)-13-methoxypodocarpa-8,11,13-triene-3,12-diol(MPTD)具有很强的体外抗DENV作用。噬斑抑制实验检测MPTD对4种不同血清型DENV的抑制作用;MTT实验检测其对Vero和Huh7两种细胞的毒性;qRT-PCR和Western blot实验分别在RNA和蛋白水平检测其抗DENV的活性。结果表明,MPTD处理可显著降低DENV感染Vero细胞的病毒滴度,其对4种DENV(1~4)的半数有效浓度(50%effective concentration,EC50)值分别为2.72±0.39、10.99±5.18、18.72±0.21和0.48±0.28μmol·L^-1。MPTD显著抑制DENV RNA的合成和E蛋白的表达,其可能抑制DENV复制的前期阶段而发挥抗病毒活性。进一步的研究显示,MPTD对DENV感染的抑制作用不是靶向病毒进入细胞阶段。MPTD对DENV具有显著抑制作用,是一种有潜在应用价值的抗DENV化合物。     

携带荧光素酶登革亚病毒颗粒的构建和鉴定

目的 拟将荧光素酶基因整合入登革病毒（DENV）亚病毒颗粒（RSPs）中,构建能用于抗体介导的感染增强（ADE）高通量筛选的研究工具。方法 将荧光素酶基因luciferase插入DENV包膜蛋白基因prME的3'端,取代prME第二个跨膜区,构建prME-luc融合基因。用prME-luc融合基因转染293T细胞,在上清中检测携带荧光素酶的登革亚病毒颗粒（RSP-luc）。结果 转染prME-luc的293T细胞可以将RSP-luc释放至培养上清中,共转染野生型prME能够提高RSP-luc的产量。Western-blot技术确认了RSP-luc中含有DENV包膜蛋白和荧光素酶形成的融合蛋白。RSP-luc易于制备并可通过超速离心分离纯化,且可通过测定荧光素酶活性快速定量。体外实验显示RSP-luc能够与Vero细胞、U937细胞以及小鼠腹腔巨噬细胞等DENV靶细胞结合,结合过程可被受体类似物硫酸肝素竞争性抑制,也可被DENV特异性抗体4E11增强。结论 RSP-luc 能够模拟DENV 感染过程,有望成为深入研究DENV 与宿主相互作用及ADE 发生机制的有效工具。     

深圳市福田区2014年登革热疫情流行病学特征分析

目的 分析2014年深圳市福田区登革热疫情流行病学特征,探讨预防控制措施.方法 对各医院报告的福田区病例进行流行病学个案调查,采集病例血液样本开展血清学或病原学检测,并划定疫点进行蚊媒调查和病例搜索.结果 深圳市福田区2014年报告登革热病例87例,发病率6.52/10万,无死亡病例;发病高峰出现在10月份,当月气温徘徊在25～30℃,适宜白纹伊蚊生长;男女性别比为1:0.47;发病年龄最小13岁,最大67岁,以青壮年为主.全区有2个暴发点,病毒型别主要为登革热Ⅰ型.疫情发生时布雷图指数最高达140.结论 深圳市福田区存在登革热流行的基本条件,疫情存在着明显的季节性、人群对登革热普遍易感等特征.有效控制疾病传播媒介白纹伊蚊是控制疫情的根本措施,疫情的早发现早报告也是有效控制措施之一.