TNF-α基因和IL-2基因共转染的肿瘤细胞体内致瘤性和瘤苗效果的观察

为了探讨两种具有协同作用的细胞因子共转染的瘤苗是否具有更好的抗肿瘤作用，我们将ＴＮＦ－α基因和ＩＬ－２基因转染Ｂ１６黑色素瘤细胞，获得同时分泌ＩＬ－２和ＴＮＦ的Ｂ１６细胞克隆株（命名为Ｂ１６－ＩＬ－２＋－ＴＮＦ－α＋细胞），并观察了其体内致瘤性和瘤苗效果。结果发现，Ｂ１６－ＩＬ－２＋－ＴＮＦ－α＋细胞的体内致瘤性显著低于ＴＮＦ－α基因或ＩＬ－２基因单独转染的Ｂ１６细胞；而且，事先接种Ｂ１６－ＩＬ－２＋－ＴＮＦ－α＋细胞的小鼠能抵抗再接种的野生型肿瘤细胞的生长，表明其具有更佳的瘤苗效果。     

FKBP12/BAX双聚体诱导细胞凋亡模型的建立

目的：建立FKBP12／BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型,并利用阳性药物对其进行鉴定。方法：RT-PCR扩增鼠源性BAX全长基因,插入pUC18载体进行测序鉴定。将鉴定正确的mBAX插入载体pC4FV1E中,构建pC4FV1E／BAX表达质粒。将表达质粒与pcDNA3．1共转染HEK293细胞,建立pCAFV1E／BAX-neo和neo基因稳定表达的细胞模型。利用形态学方法、流式细胞术等对化学药物诱导FKBP12／BAX双聚体介导的细胞凋亡进行定性及定量的分析。结果：RT-PCR、Westem blot法分别从mRNA及蛋白水平检测到FKBP12-mBAX融合基因的整合及表达;阳性化合物AP20187作用4～6h后,Giemsa染色可见明显的凋亡小体;钙依赖核酸内切酶亦被激活,出现典型的“DNA ladder”;天然产物FK506可竞争性地抑制这种阳性药物诱导的细胞凋亡。结论：FKBP12／BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型的建立,为FK506类小分子化合药物的高通量筛选提供可应用的技术平台。     

人溶菌酶cDNA克隆与CHO/dhfr-细胞中的分泌性表达

目的探讨人溶菌酶(hLYZ)cDNA的克隆及在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO/dhfr-)中的分泌性表达。方法采用RT-PCR的方法,从人胎盘组织中克隆hLYZ cDNA,构建hLYZ真核分泌性表达载体,利用脂质体共转染CHO/dhfr-细胞,筛选得到表达hLYZ的CHO抗性细胞株。结果 hLYZ基因成功连接到真核分泌性表达质粒pSecTag2/HygroB上,hLYZ融合蛋白在二氢叶酸还原酶/CHO-k1表达系统中得到成功表达。结论成功构建真核可溶性表达载体pSecTag 2/Hypro-hLYZ,为规模化、工程化生产hLYZ奠定基础。     

vWF促进intein剪接的BDD-FVⅢ的分泌和活性

vWF是由巨核细胞和血管内皮细胞合成的糖蛋白,其主要功能之一为凝血VIII因子(FVIII)的载体,防止后者被血浆酶降解。作者最近的工作证明intein可应用于双载体转移B结构域缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,通过翻译后的蛋白质反式剪接形成完整的功能性BDD-FVIII蛋白。为了研究vWF对于intein连接的BDD-FVIII分泌和活性的影响,通过intein融合的BDD-FVIII重、轻链基因和vWF基因共转染培养的293细胞,采用ELISA观察了分泌至培养上清液中的由intein剪接的全长BDD-FVIII抗原量,并用Coatest检测了由其产生的活性。结果显示,vWF基因共转染细胞上清液中,全长BDD-FVIII抗原量为(235±21)ng·mL-1,活性为(1.98±0.2)u·mL-1,明显高于未转染vWF的细胞[(110±18)ng·mL-1和(1.10±0.15)u·mL-1],也明显高于单独转染BDD-FVIII基因的对照细胞[(131±25)ng·mL-1和(1.22±0.18)u·mL-1],表明vWF基因共转染可显著改善双载体转BDD-FVIII基因后intein剪接的BD...     

重组质粒pcDNA3.1 his-hTH与pEGFP-C2共转染骨髓基质细胞源神经干细胞的实验研究

目的 构建携带人酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)目的基因片段的真核表达重组质粒-pcDNA3．1his-hTH，与pEGFP-C2共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，观察hTH基因在骨髓源神经干细胞中的表达情况。方法 应用基因重组技术，将pWAV2-TH中TH基因亚克隆到pcDNA3．1his真核表达载体，以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3．1his-hTH的正确性；将pcDNA3．1his-hTH和pEGFP-C2经电击穿孔法共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，24h后观察EGFP瞬时表达情况，10d后进行hTH基因RT-PCR，以及hTH和6His单克隆抗体的免疫组化检测。结果 (1)酶切和测序结果均证实pcDNA3．1his-hTH的正确性；(2)细胞转染24h后，荧光显微镜下可观察到EGFP的表达，80％以上细胞发出绿色荧光；10d后RT-PCR检测到细胞内有hTH基因的表达，免疫组化结果显示细胞有hTH和6His抗原表达。结论 成功构建的pcDNA3．1．his-hTH和pEGFP-C2能够共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，hTH、EGFP和6His基因在细胞内有效表达。该系统可以作为体外检测转染率、细胞移植治疗帕金森病活体跟踪移植细胞的技术平台。     

三七总皂甙增强人内皮源性一氧化氮合酶基因启动子活性

目的探讨三七总皂甙(tPNS)对人内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的调控机制。方法以基因重组技术构建人eNOS基因启动子区(-1~ -1 600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc,采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS-Luc、空载体pGL2-Basic和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染NIH3T3细胞,用细菌脂多糖(LPS)、tPNS和转移生长因子β1(TGFβ1)等因子分别刺激转染后的NIH3T3细胞,检测并比较荧光素酶/β-半乳糖苷酶活性,以确定LPS、tPNS和TGFβ1对人eNOS基因启动子转录活性的影响。结果(1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确;(2)重组载体peNOS-Luc在NIH3T3细胞中有效表达;(3)在LPS刺激下,人eNOS启动子的转录活性降低,而在tPNS和TGFβ1刺激下,其启动子的转录活性增强,其中,TGFβ1较tPNS所致的转录活性更强。结论正确构建了人eNOS基因启动子区(-1~-1 600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc;tPNS在NIH3T3细胞中增强人eNOS基因启动子的转录活性。     

重组人IL1-Ra与TGF-β1共转染软骨细胞的基因表达

目的：探讨重组人IL1-Ra与TGF-β1基因转染软骨细胞的表达情况。方法：体外分离培养兔关节软骨细胞，然后用构建的IL1-Ra与TGF-β1质粒通过脂质体介导下共转染软骨细胞，通过荧光显微镜观察转基因的表达和荧光定量PCR检测其表达。结果：荧光显微镜观察有绿色荧光蛋白表达，荧光定量PCR鉴定证实转染的软骨细胞中转基因得到表达。结论：IL1-Ra与TGF-β1基因共转染软骨细胞可以获得表达，为基因治疗骨关节炎的研究提供基础。     

RGS4对阿片受体信号转导途径中腺苷酸环化酶活性的影响

目的：探讨RGS4在整体细胞中对阿片受体信号转导途径中腺苷酸环化酶（AC）活性的影响。方法：采用共转染法将μ－受体，δ－受体和RGS4基因导入HEK－293细胞，受体结合法确定转染效率，用不同浓度的吗啡，DAMGO和DPDPE分别激活μ－受体和δ－受体，放射性蛋白竞争结合（非标记底物）法测定cAMP浓度。结果：受体被其特异的激动剂激活后，单独转染μ－受体或δ－受体基因的细胞其AC活性被抑制，且对激动剂表现出高度的剂量依赖性；空质粒（pcDNA3)转染的细胞之AC活性不受各种激动剂影响；同时转染RGS和μ－受体基因的细胞其AC活性虽然也呈现剂量依赖性抑制，但抑制的强度比单独转染μ－受体基因的细胞明显减北；RGS4和δ－受体基因共转染并不影响δ－受体对AC活性的抑制。受体结合实验显示RGS4不影响μ-受体和δ－受体的表达。结论：RGS4能逆转μ－受体对AC的抑制效应，但对δ－受体却没有相同的作用。这可能反映了不同阿片受体分子机制的差异。     

Smac/DIABLO和Survivin shRNA联合转染对大肠癌Lovo细胞凋亡的影响

背景与目的:Smac/DIABLO是一种新发现的促凋亡蛋白,通过阻滞凋亡抑制蛋白(包括Survivin),激活caspase-9和caspase-3而发挥作用.本实验研究线粒体促凋亡蛋白Smac/DIABLO和沉默凋亡抑制基因Survivin联合应用对大肠癌细胞凋亡的影响及其促凋亡机制.方法:构建Survivin的shRNA-EGFP质粒和Smac-pcDNA3.1质粒,将其用脂质体单、共转染至大肠癌Lovo细胞;Western blot检测survivin基因和Smac基因的蛋白表达;Ho-chest 33258染色观察凋亡核形态学变化,并粗略计数凋亡率;流式细胞仪PI单染测凋亡周期;caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性.结果:转染48 h后单、共转染组的Smac蛋白水平增加而Survivin蛋白水平下降;单、共转染组Hochest 33258染色可见明显的凋亡核形态学变化,凋亡率高于各对照组,且共转染组凋亡率(18.5±1.7)%高于单转染组(9.6±1.8)%、(15.0±0.3)%;Smac组G0/G1期增多为(51.0±6.2)%,而Survivin shRNA组S期细胞增多为(53.3±1.3)%(P＜0.05);caspase-3活性比Smac和Survivin shRNA共转组为(169±3)%,高于Smac组(143±5)%、Survivin shRNA组(152±6)%,且都高于各对照组(P＜0.05).结论:Smac/DIABLO和Sur-vivin shRNA协同作用激活caspase-3途径,抑制大肠癌Lovo细胞生长而促进细胞凋亡,Smac阻滞细胞周期于G0/G1期而RNA干扰Survivin后细胞周期阻滞于S期.     

利用共转染技术在CHO细胞中表达人C1抑制物

利用基因工程技术构建表达人Ｃ１抑制物（Ｃ１－ＩＮＨ）的表达质粒ｐＳＶＣ，该质粒与编码二氢叶酸还原酶（ｄｈｆｒ）的表达质粒ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ一起共转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ~细胞，获得了人Ｃ１－ＩＮＨ在真核细胞中的高效表达，表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫沉淀及免疫印迹分析，表现为一条分子量在１０６×１０~３处的明显反应条带。此外，在９４×１０~３处尚有一条稍弱的条带，可能为Ｃ１－ＩＮＨ的降解形式或搪基化不完全形式。功能活性分析采用酯酶裂解抑制法间接测定。此外，还对共转染时，目的基因质粒与标志基因质粒之间的比例进行了比较性探讨。