四君子汤对脾虚大鼠肝、心肌、胃黏膜和骨骼肌细胞线粒体损伤的修复作用

背景:脾与线粒体具有相关性,中医脾主运化不仅仅是指食物在胃肠的消化吸收,更重要的是线粒体的生物氧化产能过程。目的:分析经典健脾益气方剂四君子汤对脾虚大鼠肝、心肌、胃黏膜和骨骼肌细胞线粒体损伤的修复作用。设计:随机对照观察。单位:广州中医药大学第一附属医院二内科和广州中医药大学。材料:实验于2004-06/12在广州中医药大学第一附属医院内科实验室和广州中医药大学测试中心完成。选择SD大鼠40只,由广州中医药大学动物中心提供。小承气汤由厚朴、枳实、大黄(比例3∶3∶2)组成;四君子汤由党参、白术、茯苓、甘草(比例2∶2∶2∶1)组成,均由广州中医药大学第一附属医院药剂科提供,并由该院制剂室制成100%煎剂。方法:大鼠饲养1周后按随机数字表法分成4组,即正常对照组、脾虚模型组、自然复健组和四君子汤组。除正常对照组外,其余3组均制作大鼠长期脾虚模型。①正常对照组大鼠常规喂养,生理盐水3mL/(次·只)灌胃,隔日1次,共34周。②脾虚模型组大鼠小承气汤3mL/(次·只)灌胃,隔日1次,同时隔日喂食,共34周。③自然复健组喂养方法前26周同脾虚模型组,26周后改为常规饲养,共34周。④四君子汤组喂养方法前26周同脾虚模型组;26周后改为常规饲养,同时用四君子汤灌胃8周,4mL/(次·只),1次/d。于实验34周末麻醉断头处死大鼠后,迅速取出骨骼肌、肝脏、胃黏膜、心肌组织,用双缩脲法测定线粒体悬液的蛋白量,并根据组织质量计算出每克组织的线粒体含量;应用透射电镜观察线粒体形态。主要观察指标:各组大鼠的骨骼肌、肝、心肌、胃黏膜组织线粒体含量及超微形态。结果:40只大鼠全部进入结果分析,无脱失。①实验34周末各组大鼠骨骼肌、肝、心肌、胃黏膜组织线粒体含量比较:脾虚模型组大鼠各组织线粒体含量均显著低于正常对照组(P<0.01);自然复健组显著高于脾虚模型组(P<0.05～0.01);四君子汤组大鼠各组织线粒体含量最高,除显著高于脾虚模型组和自然复健组外(P<0.05～0.01),并显著高于正常对照组(P<0.01)。②实验34周末各组大鼠骨骼肌、肝、心肌、胃黏膜组织线粒体形态比较:脾虚模型组大鼠心肌细胞线粒体高度肿胀;肝细胞线粒体致密质粒减少或消失,嵴断裂;骨骼肌细胞线粒体数量减少,线粒体变小,线粒体膜结构破坏;胃壁细胞线粒体减少,线粒体内部结构不清,胃主细胞线粒体峭断裂。自然复健组大鼠各组织的线粒体形态改变较轻,四君子汤组与正常对照组接近。结论:四君子汤具有提高脾虚大鼠骨骼肌、肝、心肌、胃黏膜组织细胞线粒体含量,修复线粒体损伤的作用。     

兔心肌挫伤后心功能障碍及心肌细胞内Ca^2＋和线粒体ATP酶的变化

背景：心肌挫伤后心功能障碍除与心脏因受暴力直接损害导致心肌收缩性降低外，是否还与心肌细胞内Ca^2+和线粒体ATP奠的变化有关目前尚不得而知。目的：探讨心肌细胞内游离钙([Ca^2+]i)和心肌ATP酶变化在心肌挫伤后心功能障碍发生机制中的意义。设计：随机对照的实验研究。地点、材料和干预：实验在解放军第三军医大学野战外科研究所完成。选取四川健康家兔36只，雌雄不限，分在伤前，伤后2，4，8，12，24h组，每组6只。经右颈总动脉插管至左心室。采用BIM-Ⅱ型生物撞击机致成心肌挫伤模型。主要观察指标：心肌挫伤前，伤后2，4，8，12，24h测定家兔左室收缩／舒张功能、心肌细胞内[Ca^2+]i含量和心肌匀浆组织及线粒体ATP酶活力。结果：左心室收缩／舒张功能受到损害，代表左心室收缩功能的左室收缩末压(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左室内压最大上升速率(the maximal rate of left intraventricular pressure changes，+dp／dtmax)、等容收缩压(isovolemec ventricular pressure，IP)、实测心肌最大收缩速度(the maximal physiological velocity，Vpm)在伤后4—12h内恢复至伤前水平(P&;gt;0．05)；代表左心室舒张功能的舒张期左室内压下降时间常数T、左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室内压最大下降速率(the maximal rate of left intraventricular pressure changes，-dp／dtmax)在伤后24h与伤前比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．05和P&;lt;0．01)。伤前心肌细胞内[Ca^2+]i平均通道荧光为(2．26&;#177;0．16)，伤后2h开始升高为(2．63&;#177;0．47)(P&;gt;0．05)，伤后8h达最高峰为(3．56&;#177;0．33)(P&;lt;0．01)，此后开始下降，但伤后24h仍然显著高于伤前(P&;lt;0．05)。伤后2h心肌匀浆组织ATPase活性均有不同程度的下降，其中伤后4hCa^2+-ATPase活性下降明显(P&;lt;0．05)，伤后8hCa^2+-ATPase和Na^+-K^+-ATPase活性降至最低(分别P&;lt;0．05和P&;lt;0．01)，伤后12h上升与伤前无差别(P&;gt;0．05)；伤后Mg^2+-ATPase活性较伤前也有所下降，但与伤前比较无明显差别(P&;gt;0．05)。伤后4h心肌细胞线粒体ATPase活性均明显下降(P&;lt;0．05)，此后上升，至伤后24与伤前无明显差别(P&;gt;0．05)。相关分析表明LVEDP和-dp／dtmax与心肌细胞内游离钙含量变化呈明显正相关(γ=0．792，0．753，P&;lt;0．01和P&;lt;0．05)，与心肌组织Na^+-K^+-ATPase活力改变呈明显负相关(γ=-0．674，-0．691，P&;lt;0．05)，与心肌组织Ca^2+-ATPase活力改变呈明显负相关(γ=-0．613，-0．642，P&;lt;0．05)，与心肌细胞线粒体Na^+-K^+-ATPase活力改变呈明显负相关(γ=-0．622，-0．616，P&;lt;0．05)。结论：心肌挫伤后心脏功能降低，心肌细胞内[Ca^2+]i含量升高和ATP酶活性下降可能是其原因之一。     

线粒体的半自主性

线粒体(mitochondria)内含有它自身的DNA，与同细胞内核的DNA在碱基成分上不同，即鸟嘌呤和胞嘧啶碱基对含量有别，表现为裸露的环状DNA。此外，线粒体中还有RNA(mRNA tRNA rRNA)，核糖体，氨基酸活化酶等。说明线粒体具有自我繁殖所需的基本成分，它是一个含有DNA并能进行转录和翻译的细胞器，因此，有人将一体DNA称为是真核细胞的第二遗传系统。     

用免疫学方法研究肝线粒体细胞色素P—450的性质

从鼠肝中提取出两种蛋白质，分子量分别为５２ｋＤ和５０ｋＤ。用线粒体Ｐ－４５０ｃ２７／２５的克隆抗体检测，发现蛋白质与其是特异的。并且５２ｋＤ蛋白显示了线粒体２７／２５羟基化酶性质，具有高ＶＤ３２５－羟基化酶活性。５０ｋＤ蛋白缺乏这种活性，但显示１７β－还原酶和１７β－氧化酶活性。用Ｐ－４５０ｃ２７／２５的抗体作Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析，５０ｋＤ蛋白在雌性肝线粒体比在雄性中高２￣３倍。切除雌性生     

成肌细胞及其在骨骼肌研究中的应用

目的:总结成肌细胞在骨骼肌收缩功能和细胞基因治疗研究中的应用。资料来源:应用计算机检索Medline及Science Direct(Elsevier),EBSCOhost,Kluwer Online等数据库2000-01/2006-10相关骨骼肌成肌细胞及其应用研究方面的文献,检索词“myoblast,contract,mitochondria,gene treatment”,限定文献语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库2002-01/2006-10相关骨骼肌成肌细胞及其应用研究方面的文献,检索词“成肌细胞,骨骼肌收缩,基因治疗”,限定文献语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,选取包括成肌细胞特性、收缩研究及应用等方面的文献,开始查找全文。纳入标准:有关成肌细胞的生物学特性、在骨骼肌收缩中的应用、在基因治疗中应用方面的文献。排除标准:重复研究、个案报告、综述、Meta分析的文献。资料提炼:共检索到125篇关于成肌细胞研究的文献,最终纳入35篇符合标准的文献。资料综合:成肌细胞是肌组织的前体细胞,易培养、可塑性强,具有骨骼肌的许多重要生物特性,且细胞能够融合进在体骨骼肌组织中,因此在骨骼肌收缩运动引起的细胞离子浓度、线粒体功能和肌型变化等的研究以及细胞移植治疗骨骼肌肌病和修复心肌组织的研究上都有着广泛的应用。本文综述近年来成肌细胞的生物学特性和骨骼肌收缩功能及基因治疗应用等方面所取得的相关进展。结论:成肌细胞可以为骨骼肌在收缩功能上的研究提供一个很好的研究平台,其在基因治疗研究中的应用也为肌组织工程的研究奠定了基础。     

负载黄芪甲苷的心脏—线粒体双靶向递药纳米胶束改善急性心肌梗死后心脏损伤

急性心肌梗死 (Acute Myocardial Infarction,AMI) 因其高患病率和致死率严重威胁人类健康,尽管药物、介入治疗和外科手术极大程度地降低了AMI的死亡率,但AMI后仍存在持续的心肌损伤。黄芪甲苷 (Astragaloside Ⅳ,AST) 是中药黄芪的主要活性成分之一,但由于AST的疏水性特征限制了其生物利用度。在本实验中,我们开发了一种血小板膜修饰的 poly (d, L-lactic-Co-Glycolic Acid) -block (PLGA-b) -poly (Ethylene Glycol)(PEG) -Triphenylphosphonium (TPP)(PLGA-b-PEG-TPP) 聚合物纳米胶束用于包裹AST,从“器官—细胞器”层面实现“心脏—线粒体”的双重靶向功效。我们首先通过透射电镜、动态光散射、药物释放、稳定性考察等方法对载药纳米胶束进行了表征;采用活体成像法证实了载药纳米胶束的心脏靶向功效;运用小动物心脏超声、组织学、血清酶学考察了载药纳米胶束对缺血再灌注 (Isch‐ aemia/Reperfusion,I/R) 后心脏功能和心肌损伤的影响;通过考察线粒体形态、膜电位、活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS) 以及血清和心脏中炎症因子水平,评价了载药纳米胶束对心脏线粒体功能和炎症的影响,实验结果显示,相较于游离的黄芪甲苷,载药纳米胶束显著改善了I/R后心脏功能、心肌损伤、线粒体损伤以及心脏炎症,提示载药纳米胶束显著改善了AST的生物利用度和心脏保护活性。本实验的开展为疏水性中药活性单体的递送提供了一种全新策略。     

联合应用托吡酯与丙戊酸钠对癫痫幼鼠海马线粒体超微结构的影响

目的 研究应用托吡酯与丙戊酸钠后慢性癫痫幼鼠海马线粒体超微结构的变化情况。方法 将3～4周龄雄性Wistar大鼠60只，随机分为5组。B-E组为慢性癫痫组，C、D、E组于戊四氮腹腔注射后给予TPM 40 mg/kg、VPA 200 mg/kg 、TPM40mg/kg +VPA 200 mg/kg；A、B组给予等量的蒸馏水。连续用药2个月。常规固定、包埋，透射电镜观察海马CA1区神经元线粒体的结构。结果 与阳性对照组比较，托吡酯、丙戊酸钠单药组线粒体的结构基本完整,但间隙肿胀(尤其是嵴部分)，TPM与VPA联合用药组海马线粒体的线粒体肿胀较明显，嵴出现断裂和脱落，部分线粒体空泡化。结论 托吡酯、丙戊酸钠对癫痫发作所致的线粒体损伤有保护作用，而TPM与VPA联合用药可削弱这种保护作用。     

人线粒体肌酸激酶广泛型亚型在大肠埃希菌中的表达及抗体制备

目的　获得人线粒体肌酸激酶广泛型亚型 (uMtCK)的全长基因 ,在大肠埃希菌中表达 ,研制抗uMtCK多克隆抗体。方法　采用逆转录PCR从培养的肿瘤细胞 (Hela细胞 )中成功扩增出 10 6 2bp的uMtCK的基因片段 ,插入到质粒pMD18 T中 ,经酶切和测序证实为uMtCK的基因编码序列 ,再插入到质粒pQE30 ,转化大肠埃希菌 ,诱导重组质粒pQE30 uMtCK表达酶融合蛋白。经亲和层析纯化 ,并进行SDS PAGE、westernblot鉴定及酶活性测定。纯化的uMtCK蛋白免疫家兔制备抗uMtCK多抗。结果　RT PCR扩增出的片段经酶切鉴定和测序证实为uMtCK的基因 ;在大肠埃希菌M15中实现了高效、可溶性的融合表达 ,表达量约 17%。重组uMtCK具有CK样催化活性 ,表明原核表达的uMtCK具有类似于天然蛋白质的生物学活性。经免疫印迹分析 ,制备的抗uMtCK多抗适合作uMtCK的进一步分析之用。结论　人uMtCK在大肠埃希菌中实现了高效表达 ,制备了针对uMtCK的抗体。     

Bcl-2,Bax和线粒体膜蛋白在一氧化氮供体诱导HL-60细胞凋亡中的改变

本研究探讨外源性一氧化氮 (NO)供体硝普钠 (SNP)对HL 6 0细胞诱导凋亡的可能机制。将HL 6 0细胞与SNP在体外培养 ,用DNA片段原位末端标记法 (TUNEL)测定原位细胞凋亡率 ;用流式细胞仪测定细胞DNA倍体和周期分析及Bcl 2、Bax、线粒体膜蛋白表达率的变化。结果表明 :SNP可诱导HL 6 0细胞凋亡 ,两者之间有明显的量效和时效关系。 1.0mmol/LSNP作用 4 8小时后 ,HL 6 0细胞的凋亡率分别为亚二倍体峰 (4 2 .2± 3.5 ) % ,TUNEL测定凋亡细胞率为 (5 2 .5± 7.6 ) % ,显著高于空白对照组和同浓度的高铁氰化钾 (PFC)组 ;Bax基因蛋白和线粒体膜蛋白 (APO2 .7)表达增加 ,bcl 2基因蛋白表达降低。Bax、Bcl 2和APO2 .7的表达率与SNP两者之间也有明显的量效和时效关系。结论 :外源性一氧化氮供体诱导HL 6 0细胞凋亡过程中 ,线粒体膜蛋白表达显著上调并伴随Bax和Bcl 2蛋白的表达改变。     

抗线粒体抗体在原发性胆汁性肝硬化筛查中的应用

目的探讨临床医生对抗线粒体抗体(AMA)检测的应用情况。方法回顾性分析上海长征医院2011年1月至2015年8月259例AMA阳性患者信息,并在临床医生提出AMA检测要求组与未提出检测要求组之间进行比较。结果 259例AMA阳性患者中,临床医生提出AMA检测要求的181例(占70%),没有提出AMA检测要求的78例(占30%);确诊为原发性胆汁性肝硬化(PBC)的204例(占80%),未确诊PBC的55例(占20%)。临床医生提出AMA检测要求组感染科和消化科送检比例和PBC确诊比例均显著高于未提出AMA检测要求组(P0.01)。在临床医生提出AMA检测要求组中,送检例数由多到少的科室依次为消化科、感染科、肝移植科、风湿免疫科和其他科室;而在临床医生未提出AMA检测要求组中,送检例数由多到少的科室依次为风湿免疫科、肾内科、神经内科、感染科、消化科和其他科室。在临床医生提出AMA检测要求组中,未确诊PBC 18例,未确诊原因包括已诊断为乙型肝炎肝硬化7例,患者不同意肝活检6例,患者失联5例。在临床医生未提出AMA检测要求组中,未确诊PBC 37例,未确诊原因包括实验诊断科未告知临床医生AMA阳性16例,患者不同意肝活检12例,患者失联6例,实验诊断科告知临床医生但后者未安排患者做进一步检查3例。结论消化科和感染科的临床医生对PBC的认识较为深入,较少出现忽视AMA检测的情况;但风湿免疫科、肾内科和神经内科的临床医生对PBC常常忽视AMA的检测,而这些科室AMA阳性并不罕见。