Reis-Bucklers角膜营养不良的组织病理学研究

目的:探讨Reis-Bucklers角膜营养不良的组织病理学改变.方法:取1家系中3例3眼Reis-Bucklers角膜营养不良患者角膜移植术后的病变角膜,3眼的1/2角膜组织行HE、PAS、刚果红、Masson、阿辛蓝染色后光学显微镜观察.以2例2眼正常角膜组织(眼库捐献角膜)作为对照.结果:Reis-Bucklers角膜营养不良患者前弹力层消失,被异常组织代替.HE染色证实病变主要累及角膜前弹力层,PAS、刚果红、Masson染色均为阳性,阿辛蓝染色为阴性.结论:该Reis-Bucklers角膜营养不良家系为前弹力层地图型病变,角膜异常沉着物性质为细胞外淀粉样纤维蛋白沉着.     

脑源性神经营养因子（BDNF）对高糖环境下视网膜Müller细胞的保护作用

目的　探讨脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）对高糖环境下视网膜Müller细胞的保护作用。方法　该研究实验分为3组,对照组、高糖组（对照组中添加25 mmol·L^-1葡萄糖）、BDNF组（高糖组添加100 mg·L^-1 BDNF）,实验干预24 h后,在倒置显微镜下观察各组细胞形态和生长状态,并进行各项指标检测。用倒置荧光显微镜观察各组视网膜Müller细胞的生长状态并检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）荧光强度;流式细胞仪检测视网膜Müller细胞凋亡率,Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达情况。结果　与对照组相比,高糖组Müller细胞生长状态差,细胞突起减少,细胞失去原有形态,由原来的不规则形变为类圆形,折光性增强;而BDNF组与对照组相比无明显差异;与高糖组相比,BDNF组细胞生长状态明显改善,细胞突起增多,细胞折光性减弱。与对照组相比,高糖组Müller细胞内ROS含量显著升高（P<0.01）,BDNF组细胞内ROS含量亦升高（P<0.01）;与高糖组相比,BDNF组ROS含量显著减少（P<0.01）。与对照组相比,高糖组细胞凋亡率显著升高（P<0.01）,BDNF组凋亡率仍高于对照组（P<0.01）;与高糖组相比,BDNF组凋亡率明显减少（P<0.01）。与对照组相比,高糖组Bcl-2蛋白相对表达量显著减少,Bax蛋白相对表达量明显升高,Bcl-2/Bax二者比值降低（P<0.01）,BDNF组与对照组相比相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）;与高糖组相比,BDNF组Bcl-2蛋白相对表达量明显升高,Bax蛋白表达减少,Bcl-2/Bax比值升高（P<0.01）。结论　高糖环境能诱导视网膜Müller细胞凋亡,而给予外源性BDNF能够显著抑制高糖环境诱导的视网膜Müller细胞凋亡,对视网膜Müller细胞起到保护作用。     

多囊卵巢综合征患者显著升高的抗苗勒管激素水平对超促排卵的影响

目的 探讨多囊卵巢综合征(PCOS)患者血清抗苗勒管激素(AMH)水平升高的原因和对体外受精(IVF)促排卵反应的影响。方法 回顾性分析第1次行长方案助孕的PCOS患者(n=158)和排卵正常的卵巢多囊样改变(PCOM)患者(n=256)的临床资料,将患者按“获卵数”分组,获卵数≤5个,为低反应组,获卵数6~14个为正常反应组,获卵数≥15个为高反应组,比较各组间治疗后各项指标的差异。结果 PCOM组和PCOS组的血清AMH值、窦卵泡数(AFC)、血清AMH/AFC比值(AMH×100/AFC总数)组间有统计学差异(P0.05)。促性腺激素(Gn)使用总量和Gn使用时间组间均有统计学差异(P0.05)。PCOM组中,随着AMH水平、AFC总数及AMH/AFC比值的增加,卵巢低反应者也增加。PCOS组中,卵巢反应低下组较正常反应及卵巢高反应组具有更高的AMH水平、AFC总数及AMH/AFC比值。结论 PCOS患者高血清AMH水平可能并不仅仅是因为窦卵泡数量增多的累加效应,同时可能是单个窦卵泡异常过多分泌所致。AMH异常升高可能影响卵巢对Gn的敏感性,但其作用机制仍需更深入研究。     

表皮生长因子对人眼Müller细胞增生迁移的影响及其作用机制

背景研究证实表皮生长因子（EGF）可促进鼠视网膜Müller细胞的增生和迁移,但EGF能否促进人眼Müller细胞的增生迁移尚未见报道。目的探讨人眼Müller细胞能否自身表达和分泌EGF及EGF对Müller细胞增生迁移的影响及其作用机制。方法同一代人永生株Müller细胞系MIO—M1细胞用高糖DMEM进行培养,利用MTT比色法观察不同质量浓度EGF作用24、48、72h,不同浓度CoCl2作用12h和24h,加入导致Müller细胞半数致死量的CoCl,浓度前2h加入不同质量浓度EGF的Müller细胞增生情况;Transwell小室观察正常及CoCl2缺氧条件下用不同质量浓度EGF作用24、48、72h后Müller细胞的迁移情况;采用ELISA法观察Müller细胞表达和分泌EGF的情况;通过Westernblot法检测体外不同条件培养下EGF对ERK1/2及Akt信号转导通路的作用。结果正常培养条件下,不同质量浓度的EGF作用后Mfiller细胞的吸光度（A570）值的总体比较差异有统计学意义（F=123．765,P=0．000）,100mg／LEGF促Müller细胞增生作用最强,为对照组的1．6倍,10mg／LEGF促Müller细胞迁移的作用最强,为对照组的4．5倍。各EGF组Müller细胞的A570,值均明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈O．01）。缺氧条件下培养,Müller细胞半数致死量的CoCl2浓度为600nmol／L,提前2h加入10～100阻g／LEGF后,EGF对抗缺氧所致Muller细胞的损伤作用最明显。700nmol／LCoCl2致Müller细胞损伤80％时其自身低分泌7．8ng／LEGF。10～100mg／LEGF作用Müller细胞促增生迁移作用信号最明显,600nmol／ LCoCl2作用Müller细胞24h后ERKl／2及Akt信号强度减弱,提前2h加入外源性EGF后,ERK1／2及Akt两条信号通路最明显。结论EGF能以剂量依赖的方式促进体外培养的Müller细胞增生及迁移。正常培养条件下的Müller细胞自身不表达,缺氧条件下Müller细胞自身可少量分泌EGF。EGF可能通过ERK1／2及Akt信号转导通路介导Müller细胞的增生和迁移,并对CoCl2损伤的Müller细胞发挥保护作用。     

KLF4反义基因对内皮细胞血管性血友病因子、纤溶酶原抑制物-1表达的影响

目的 探讨类果蝇分节因子4(Kroppel-like factor4,KLF4)反义基因对原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中血管性血友病因子(vWF)、纤溶酶原抑制物-1(PAI-1)表达的影响,明确KLF4在内皮细胞调节血栓形成中的作用.方法 胰蛋白酶消化法分离和培养原代HUVEC,采用同源重组方法 构建携带反义KLF4基因腺病毒,实时定量(Real-time)PCR、Western blot、激光共聚焦显微镜法检测转染KLF4反义基因后内皮细胞KLF4、PAI-1、vWF mRNA和蛋白的表达.结果 成功构建出携带反义KLF4基因片段的重组腺病毒(Ad-反义KLF4),以感染复数值200的重组腺病毒感染HUVEC,KLF4 mRNA相对表达水平由0.59±0.01下降至0.44±0.06,同时HUVEC中vWF mRNA相对表达水平升至1.17±0.05,与感染携带绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)组(1.04±0.03)相比,差异均具有统计学意义(P<0.05).而HUVEC中PAI-1 mRNA相对表达水平增加至0.73±0.01,与感染Ad-GFP组(0.67±0.04)相比,差异无统计学意义(P>0.05).与感染Ad-GFP组相比,感染Ad-反义KLF4的HUVEC中vWF、PAI-1蛋白表达水平明显增加.结论 KLF4反义基因可下调KLF4表达,促进内皮细胞中vWF、PAI-1的表达.KLF4可能参与内皮细胞抗栓作用的转录调节.     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞近视因子基因的表达

目的研究视网膜近视因子基因在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的表达变化。方法3～4周龄断乳三色豚鼠40只,取20只建立近视眼模型（以右眼作为实验眼,以对侧未遮盖眼作自身对照）,剩余的20只豚鼠作正常对照。用眼罩遮盖法建立豚鼠近视眼模型,用酶消化法原代培养其视网膜Müller细胞。RT-PCR检测酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）、诱导型一氧化氮合成酶（induciblenitric oxide synthase,iNOS）、神经型一氧化氮合成酶（neu-ronal nitric oxide synthase,nNOS）、内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）、视黄醛脱氢酶（retinaldehyde dehydrogenase,RALDH）、醛脱氢酶（aldehydedehydrogenase,ALDH）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fi-broblast growth factor,bFGF）、转化生长因子β（transforminggrowth factor-β,TGF-β）的mRNA在正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞中的表达情况。数据分析采用One-way ANOVA检验。结果眼罩遮盖10d后,遮盖眼眼轴延长,近视形成。酶消化法成功培养出视网膜Müller细胞。正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞均阳性表达nNOS、bFGF、TH、TGF-βmRNA,且遮盖眼表达nNOS、bFGF和TGF-βmRNA上调（P〈0.05）,TH mRNA下调（P〈0.05）。iNOS mRNA仅在遮盖眼视网膜Müller细胞阳性表达。三组视网膜Müller细胞均不表达eNOS、RALDH和ALDHmRNA。结论豚鼠近视眼视网膜Müller细胞表达nNOS、iNOS、bFGF和TGF-βmRNA上调,TH mRNA下调。Müller细胞是近视眼视网膜信号因子一氧化氮（nitric oxide,NO）、多巴胺（dopamine,DA）、bFGF和TGF-β的一个重要来源。     

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜Mller细胞的比较

目的:探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜Mller细胞的可行性和区别。方法:体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜Mller细胞,免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜Mller细胞。分别用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP-N1转染视网膜Mller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间。结果:荧光显微镜下检测转染后1d,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白。转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP-N1转染Mller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高。两者比较有统计学意义(P<0.01)。随后,两者转染效率均逐渐降低。电穿孔转染后的PEGFP-N1可在视网膜Mller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d。结论:脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Mller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长。     

补肾调冲方对半乳糖致POF大鼠始基卵泡募集因子GDF-9、AMH表达的影响

目的:研究补肾调冲方对半乳糖致POF大鼠卵巢功能的调节,探讨补肾调冲方通过调控卵巢始基卵泡募集因子GDF-9及AMH调节卵巢功能及治疗POF的机制。方法:建立半乳糖致POF大鼠模型,将造模成功的POF大鼠随机分为模型组与治疗组,每组各20只,另设正常对照组。于PND80开始,治疗组大鼠每日灌服补肾调冲方水溶液,模型组及空白组大鼠每日灌服等体积生理盐水,共4周。实验结束后光镜下计数各组大鼠卵巢内各级卵泡数目,ELISA法检测各组大鼠血清FSH、LH及E2水平,Real-time PCR法检测各组大鼠卵巢内GDF-9及AMH mRNA表达水平。结果:①补肾调冲方可使POF大鼠动情周期趋于正常,并能明显降低血清FSH、LH水平(P<0.05),提高E2水平(P<0.05),从而改善POF大鼠血清高促性腺激素低雌激素状态;组织形态学检测结果显示治疗组大鼠卵巢体积较POF模型组增大,各级卵泡生长较好,颗粒细胞层次多,黄体数目明显增多;始基卵泡、窦前卵泡及窦状卵泡数目均较模型组增多,闭锁卵泡数目则明显减少。②与正常组比较,POF大鼠卵巢GDF-9及AMH mRNA水平均明显降低(P<0.01),而治疗组大鼠卵巢GDF-9及AMH mRNA水平较模型组明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论:补肾调冲方治疗POF的作用机制之一可能是通过上调卵巢局部始基卵泡募集因子GDF-9及AMH的表达,促进卵泡的生长发育,抑制卵泡的过度耗竭与闭锁,恢复始基卵泡的正常募集状态,从而抑制卵巢功能的过早衰竭。     

玉女煎颗粒剂质量标准研究

目的：建立玉女煎颗粒剂的质量标准。方法：采用TLC对处方中熟地、知母、牛膝进行鉴别;用HPLC测定地黄中毛蕊花糖苷的含量。色谱柱为SunfireTMC18（250 mm×4.6 mm,5μm）;流动相为乙腈-0.1%醋酸溶液（16∶84）,柱温：30℃,流速：1.0 ml·min-1,检测波长334 nm,进样量：20μl。结果：在TLC色谱中检出熟地的特征成份毛蕊花糖苷、知母的特征成份菝葜皂苷元、牛膝特征成份杯苋甾酮,斑点清晰,分离度好;毛蕊花糖苷在0.163-0.612μg与峰面积呈良好的线性关系,r=0.999 9,平均回收率为101.3%,RSD为2.7%（n=6）。结论：该方法简便、可靠、准确,适用于该剂型的质量控制。     

Comparative study of intertrochanteric fracture fixation using proximal femoral nail with and without distal interlocking screws

BACKGROUNDIntertrochanteric (IT) fracture is one of the most common fractures seen in an orthopaedic practice. Proximal femoral nailing (PFN) is a common modality of fixing IT femur fracture. We retrospectively studied whether a PFN with two proximal lag screws can be done without distal interlocking screws in the 31-A1 and 31-A2 fracture patterns according to the Arbeitsgemeinschaft für Osteosynthesefragen/Orthopaedic Trauma Association (AO/OTA) guidelines for IT femur fractures.AIMTo compare the outcomes of IT fractures (AO/OTA 31-A1 and 31-A2) treated by PFN with and without distal interlocking screws.METHODSWe carried out a retrospective study of 140 patients in a tertiary care centre who had AO/OTA type 31-A1 and 31-A2 IT fractures. We divided the patients into two groups, in which one of the groups received distal interlocking screws (group 1) and the other group did not (group 2). The subjects were followed up for a mean period of 14 mo and assessed for radiological union time, fracture site collapse, mechanical stability of implant, and complications associated with the PFN with distal interlocking and without distal interlocking. Then, the results were compared.RESULTSPFN without distal interlocking screws has several advantages and gives better results over PFN with distal interlocking screws in the AO/OTA 31-A2 fracture pattern. However, similar results were observed in both groups with the fracture pattern AO/OTA 31-A1. In patients with fracture pattern AO/OTA 31-A2 treated by PFN without distal interlocking screws, there were minimal proximal lock-related complications and no risk of distal interlock-related complications. The operative time, IITV radiation time and time to radiological union were reduced. These patients also had better rotational alignment of the proximal femur, and the anatomy of the proximal femur was well maintained. It was also noted that in the cases where distal interlocking was performed, there was a gradual decrease in neck shaft angle, which led to varus collapse and failure of bone-implant construct in 21.40%.CONCLUSIONIn fracture pattern AO/OTA 31-A2, PFN without distal interlocking had better results and less complications than PFN with distal interlocking.