人甲胎蛋白基因启动子siRNA表达载体的构建及效应鉴定

目的：探索基于人甲胎蛋白基因启动子构建的siRNA表达载体介导目的基因RNA干扰的可行性，为实现肝癌细胞靶向RNAi治疗作一初步研究。方法：PCR法扩增获得人甲胎蛋白基因启动子并插入pSilencer1．0-U6中以置换其U6启动子；依据hLRH-1基因RNAi靶位点设计出siRNA模板DNA，体外合成相应寡核苷酸片段后经退火形成短双链，再克隆构建成靶向人hLRH-1基因siRNA表达载体；脂质体转染法将上述重组质粒转入HepG2细胞中，实时定量PCR法初步分析所建系统在AFP表达细胞中触发靶基因hLRH-1的RNAi效应，以及hLRH-1调控下游靶基因的表达改变。结果：获得人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体pSiAFP。所建的RNAi载体系统可在表达AFP的HepG2细胞中有效诱导靶基因hLRH-1表达下调，抑制率约达85％；同时调控hLRH-1下游靶基因CyclinE 1与Oct4的表达相应下调。结论：人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体可在表达AFP的HepG2细胞中有效介导靶基因的RNAi效应。     

利用RNA干扰技术抑制环氧合酶-2表达对人胃癌细胞系SGC-7901增殖和凋亡影响的实验研究

目的研究环氧合酶(COX)-2表达与肿瘤细胞增殖和凋亡的关系,探讨利用RNA干扰技术作为肿瘤基因治疗的方法。方法构建靶向COX-2的短发夹状双链RNA(shRNA)的真核表达质粒WBH1转染人胃癌细胞系SGC-7901,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。四甲基偶氮唑蓝(MTT)和流式细胞仪检测COX-2表达被抑制后细胞的增殖和凋亡情况。15只裸鼠随机分为3组,每组5只,皮下接种胃癌细胞。抑制组接种转染抑制质粒的胃癌细胞;正常对照组接种未转染的胃癌细胞;阴性对照组接种转染阴性对照质粒的胃癌细胞。4周后观察比较各组裸鼠皮下形成瘤体的大体和病理情况并计算抑瘤率。结果WBH1高效特异地抑制了人COX-2的表达,抑制率达70.42%。COX-2表达被抑制后,细胞增殖受到明显抑制(P=0.002),细胞凋亡率明显增高,与未转染和转染阴性对照质粒的胃癌细胞的凋亡率相比有统计学意义(52.28%±17.91%、0.52%±0.27%、0.54%±0.16%,P=0.009,实验重复5次)。正常对照组和阴性对照组所有裸鼠均有瘤体形成,平均瘤重分别为(0.490g±0.017g,5只)和(0.490g±0.013g,5只)。抑制组仅2只有瘤体形成平均瘤重0.050g±0.003g,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),抑瘤率为89.8%。结论COX-2与肿瘤细胞的增殖和凋亡密切相关,抑制细胞中COX-2的表达可以抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。通过构建靶向COX-2的shRNA真核表达载体导入细胞可以高效特异地抑制人胃癌细胞中COX-2的表达。     

RNA干扰抑制脊髓源星形胶质细胞sIL-6R基因表达的实验研究

目的:靶向白细胞介素6受体(sIL-6R)基因构建具有高干扰效率的RNA干扰载体,观察其对脊髓源星形胶质细胞sIL-6R基因表达抑制效果。方法:靶向sIL-6R基因设计3条短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸片段,构建sIL-6R siRNA重组质粒真核表达载体,转染脊髓源星形胶质细胞,筛选出对sIL-6R基因干扰效率最高的sIL-6R siRNA,用免疫组化染色、RT-PCR及Western blot技术观察其对脊髓源星形胶质细胞sIL-6R基因表达抑制效果。结果:成功构建sIL-6R siRNA重组质粒真核表达载体,免疫组化染色、RT-PCR及Western blot检测结果证实sIL-6R siRNA能显著下调sIL-6R的表达。结论:sIL-6Rs iRNA重组质粒真核表达载体对脊髓损伤后sIL-6R表达有明显的抑制作用,为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤修复中的应用奠定了前期基础。     

GFAAS测定高钙样品中铅含量的基体改进剂探讨

目的：针对石墨炉原子吸收光谱法，测定高钙食品中铅的基体干扰情况，采用磷酸二氢铵-氯化钯作为混合基体改进剂，提高灰化温度和原子化温度，减少灰化阶段中铅的损失和原子化阶段的气相干扰。方法：用仪器自动进样，分别加入基体改进剂：磷酸二氢铵、氯化钯和磷酸二氢铵-氯化钯，改变灰化温度或原子化温度，测定高钙食品中的铅的吸光度，并比较它们消除干扰的程度。结果：根据测定的回收率和背景吸收值，确定磷酸二氢铵-氯化钯作基体改进剂，发现它消除钙对铅的干扰效果较为理想。结论：用选定的混合基体改进剂，测定标准物质中的铅的含量结果符合其标准，说明测铅时加入基体改进剂能消除食品中钙的基体干扰。     

shRNA干扰AKT基因对Jeko-1细胞增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响

目的:探讨RNA干扰沉默AKT基因对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株的增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响。方法:设计针对AKT基因短发夹RNA,将其连入pGPU6/GFP/Neo质粒中,构建AKT shRNA真核表达载体,经脂质体转染入Jeko-1细胞,应用RQ-PCR及Western blot鉴定其干扰效果,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞凋亡的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白信号及通路相关蛋白p-AKT、Notch1、HES1的变化。结果:AKT shRNA转染Jeko-1细胞后,AKT的mRNA和蛋白表达均明显下降,有统计学意义(P0.05);转染组细胞增殖率明显低于Neg-shRNA组和空白对照组(P0.05),AKT shRNA传染48 h后,凋亡率为(37.72±4.39)%,而NegshRNA组和空白对照组分别为(2.62±1.53)%、(1.57±0.42)%,差异有统计学意义(P0.01);凋亡相关蛋白BCL-2表达下降,而BAX、caspase-3、caspase-9表达上升;PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-AKT磷酸化水平下降、Notch1信号通路相关蛋白Notch1、HES1表达下调。结论:干扰沉默AKT基因可抑制套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能是特异性抑制PI3K/AKT信号通路也能下调Notch1信号通路的活性。     

硝酸甘油注射液细菌内毒素检查法

目的：建立硝酸甘油注射液的细菌内毒素检查方法;方法：按《中国药典》2005年版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法进行试验和结果判断;结果：硝酸甘油注射液在125ug·ml^-1稀释浓度下对细菌内毒素检查法无干扰作用,其细菌内毒素限值L为0．10EU·mg～;结论：采用细菌内毒素检查法检查硝酸甘油注射液的细菌内毒素是可行的。     

紧急避孕知多少

一、什么是“紧急避孕” 紧急避孕是指那些在无防护性生活后几小时或几天内，女方为防止妊娠而使用的一种临时性补救措施。紧急避孕在月经周期的任何时间都可以使用。它是通过干扰妇女生殖周期而起作用，进行阻止或延期排卵，干扰受精和阻止受精卵植入。     

RNA干扰p21基因对X射线诱导细胞周期解耦联的影响

目的 研究RNA干扰p21基因对X射线诱导细胞周期解耦联的影响。方法构建RNA 干扰质粒pSilencer3.1-H1 neo-p21,并采用脂质体转染将质粒转入EL-4细胞。 采用单克隆抗体免疫荧光标记及流式细胞术 (FCM) 检测蛋白表达的变化。采用碘化丙啶(PI)荧光标记及FCM检测多倍体细胞数的变化。结果量效实验证实, 1.0~4.0 Gy X射线照射后24 h,EL-4细胞中P21蛋白表达与对照组相比较显著增高。 时效实验证实, 4.0 Gy X射线照射后8~72 h, EL-4细胞中P21蛋白表达与对照组相比较显著增高。 实验证实, 0.5~6.0 Gy X射线照射后,EL-4细胞的八倍体细胞数未见明显变化,X射线照射不诱导EL-4细胞周期解耦联。RNA干扰实验证实, p21基因沉默后, P21蛋白表达于 4.0 Gy照射后24 及48 h, 干扰质粒组与空质粒对照组相比较显著降低;与此同时,干扰质粒组的八倍体细胞数与空质粒组相比较显著增高。结论RNA干扰p21基因使P21蛋白表达抑制后,X射线照射可诱导EL-4细胞周期解耦联。提示,P21蛋白可能在电离辐射诱导细胞周期解耦联中起重要作用。     

地氟醚复合丙泊酚用于"深麻醉"下拔管效应的临床观察

气管拔管时对术后病人血流动力学的干扰,导致血压急剧升高,心率增快,易导致心脑血管意外的发生,且全麻术后病人面临疼痛及气管导管带来的不舒适感.本观察即为验证此方法能否减弱术后拔管的应激和血流动力学变化而导致潜在危险的发生.