双苯氟嗪对脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

目的研究双苯氟嗪对局灶性脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响。方法采用endothelin1诱导的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,流式细胞术检测大脑皮层和纹状体神经细胞凋亡百分率、Bcl2和Bax蛋白表达量。结果假手术组皮层和纹状体细胞凋亡率低,分别为(1.26±0.15)%和(2.50±0.35)%,溶剂组细胞凋亡率明显增高,分别为(9.34±1.22)%和(10.58±1.44)%;双苯氟嗪可以降低皮层和纹状体细胞凋亡率,并呈现明显的剂量依赖关系〔皮层:10mg·kg-1组(7.92±0.76)%,20mg·kg-1组(6.78±0.77)%,40mg·kg-1组(6.00±0.71)%,r=0.9559,P<0.01;纹状体:10mg·kg-1组(9.76±1.47)%,20mg·kg-1组(8.52±0.60)%,40mg·kg-1组(7.22±1.39)%,r=0.9845,P<0.01〕。Flu20mg·kg-1组可以降低缺血后大脑皮层的细胞凋亡百分率(8.12±0.94)%(P<0.05),但对纹状体细胞凋亡百分率无明显影响(P>0.05)。对Bcl2和Bax蛋白表达量的测定结果显示,假手术组皮层和纹状体均显示高水平的Bcl2表达,Bcl2和Bax比值最高,分别为:皮层1.30±0.08,纹状体1.64±0.10;溶剂组皮层和纹状体Bax表达增加,Bcl2和Bax比值明显低于假手术组,为1.03±0.12和1.00±0.04;Dip20、40mg·kg-1可以明显增加Bcl2表达,皮层和纹状体的Bcl2和Bax比值均高于溶剂组,而Dip10mg·kg-1组和Flu20mg·kg-1组不能对抗Bcl2和Bax比值的降低。结论双苯氟嗪可以明显抑制脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡,其抗凋亡作用与增加Bcl2表达有关。     

KCNQ2/3钾通道电流特征及M_1受体的调节作用

目的观察KCNQ2/3通道电流特征及M1受体激活对该电流的调节作用。方法以CHO细胞作为表达体系,用脂质体共转染KCNQ2、KCNQ3钾离子通道及毒蕈碱型M1受体。全细胞膜片钳方法,观察KCNQ2/3电流特征,药理学阻断剂的作用及M1受体激活对电流的调节。结果KC-NQ2/3电流呈现慢激活、低阈值、非失活、电压依赖性的外向钾离子电流特点,其激活电压的阈值在-60 mV,半数激活电压值(-26.8±1.2)mV,其去活曲线可用双指数方程拟合,fτast约101 m s;sτlow约为309 m s。该电流对4-AP,Ba2+,TEA不敏感,L inop ird ine抑制KCNQ2/3电流IC50为(6.5±0.83)μmol.L-1。乙酰胆碱激活M1受体后会可逆性地抑制KCNQ2/3电流,其抑制的IC50为(0.7±0.05)μmol.L-1。结论KCNQ2/3通道作为神经细胞M通道的分子基础,其电流特征与M电流一致,L inop ird ine对其有较强阻断作用,神经递质乙酰胆碱通过激活M1受体明显抑制该通道电流。研究KCNQ2/3通道电流特征及受体调节规律,对于理解与中枢兴奋性有关的疾病如:惊厥、癫痫、阿尔采末病等发生机制有重要指导意义。     

关木通药材中马兜铃酸A的药动学研究

目的　采用高效液相色谱法测定血浆中马兜铃酸A的浓度,研究小鼠灌胃给予关木通提取液后体内马兜铃酸A的药动学特点。方法　采用DiamonsilTMC18色谱柱(250mm×4. 6mm, 5μm),以甲醇水冰乙酸(72∶27∶1)为流动相,流速1. 0mL·min-1,检测波长315nm。小鼠按马兜铃酸A4. 0mg·kg-1灌胃给予关木通提取液后,经HPLC法测定血浆药物浓度。结果　马兜铃酸A在0. 1098~3. 66mg·L-1的浓度范围内线性关系良好(r=0.9998,n=7),最低检测浓度为0. 0183mg·L-1。马兜铃酸A高、中、低3种不同浓度的平均回收率及相对标准偏差分别为97. 07% (1. 0% ), 97. 10% (1. 1% )和99. 36% (0. 8% ),该法的日内和日间精密度RSD值均小于9. 3%。小鼠给药后,药动学房室模型为一室模型,主要药动学参数T1 /2(ka),T1 /2(ke),Tmax, AUC, Cmax,CL/F(S),V/F(c)分别为: 3. 94, 16. 29, 10. 65min, 104. 88(mg/L)·min, 2. 84mg/L, 0. 038mg/kg/min/(mg/L), 0.89(mg/kg) /(mg/L)。结论　本实验建立了关木通药材中马兜铃酸A血药浓度的HPLC测定方法,阐明了马兜铃酸A的药动学特征。     

阿德福韦酯在大鼠体内的药代动力学和组织分布特性研究

目的研究阿德福韦酯在大鼠的体内过程特性及绝对生物利用度,为临床合理用药提供依据.方法大鼠随机分组,分别一次性灌胃给药阿德福韦酯3.0,1.0,0.3 mg·Kg-1,静脉注射0.54 mg·Kg-1,采用高效液相色谱法检测阿德福韦在生物样品中的含量,并计算药代动力学参数.大鼠口服阿德福韦酯后于0.7,3,6h测定各组织的药物浓度.口服阿德福韦酯1.0 mg·Kg-1,24h内收集胆汁,测定药物胆汁排出率.用平衡透析法测定药物的人血清蛋白结合率.结果该药药代动力学过程符合无滞后时间的二室模型,高、中、低三个剂量的AUC(0～∞)分别为10.7±1.19,3.91±0.315,1.54±0.074 μg·mL-1·h;tmax在0.62～0.76 h之间,Cmax与给药剂量成正比,分别为2.26±0.299,0.758±0.0529,0.388±0.0269 μg·mL-1;t1/2 为5.0～7.3 h;绝对生物利用度为分别为(53±5.2)%,(51±8.1)%,(42±6.0)%.静脉注射给药阿德福韦后t1/2(ke) 为7.5±0.16 h,AUC(0～∞)为 6.35±1.58 μg·mL-1·h.母体药物阿德福韦在组织中分布情况为肾>肝>胃,其他组织中的浓度均远低于血浆中浓度.胆汁累积排泄率低于2%,在0.10～4.0μg·mL –1的浓度范围内,人血清蛋白结合率为<5%.结论阿德福韦酯在动物体内迅速吸收,消除半衰期较长,胆汁不是该药的主要排泄途径,血液及主要脏器无药物蓄积.阿德福韦是生物样品中检测到的唯一代谢产物.     

重组质粒pcDNA3.1-IL-15转染对小鼠骨髓DC上表面分子的表达及功能的影响

目的: 探讨重组质粒pcDNA3. 1 IL- 15对小鼠骨髓树突状细胞(DC)表面共刺激分子的表达及免疫功能的影响。方法: 构建真核表达质粒pcDNA3. 1 IL- 15, 以其转染小鼠骨髓DC。用流式细胞仪检测转染的DC表面CD40、CD80及CD86的表达, 并分析转染的DC刺激脾淋巴细胞中CD4 、CD8 T细胞亚群的变化。用MTT比色法检测转染的DC刺激T细胞增殖的作用。用ELISA法检测T细胞产生IFN- γ的水平。结果: pcDNA3. 1- IL- 15转染的DC表面CD40、CD80及CD86的表达均有不同程度的升高。重组质粒转染的DC可诱导小鼠脾淋巴细胞中CD4 、CD8 T细胞增殖, 但CD4 /CD8 T细胞的比值降低。结论: 重组质粒pcDNA3. 1 -IL- 15转染可提高DC表面共刺激分子的表达并增强其免疫功能。     

氨基胍降低肺纤维化大鼠肺成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白

肺纤维化主要的病理变化是肺间质中成纤维细胞活化为肌成纤维细胞（Myofibroblast，MF）及大量细胞外基质聚集。已知转化生长因子-β1（Transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）是诱导肺成纤维细胞表达MF的标志性蛋白-平滑肌肌动蛋白α-smooth muscl eactin，α-SMA）的最重要的细胞因子。近年来一氧化氮（Nitric oxide，NO）在肺纤维化中的作用日益受到关注。研究者多以一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）抑制剂和NO的供体物质作为工具药，探讨NO与肺纤维化的关系。     

线粒体神经酰胺酶通过其下游代谢产物1-磷酸鞘 氨醇，上调K562细胞Bcl-2蛋白表达水平

目的：将线粒体神经酰胺酶（mtCDase）转 染到K562细胞，观察线粒体神经酰胺酶的细胞生物学效应。方法:以脂 质体介导将含有mtCDase cDNA的pCDNA3.1/His-CDase质粒转染到K562细胞，G418筛选阳性 克隆，建立稳定表达mtCDase的K562TC细胞株。Annexin Ⅴ/PI法、FCM及Western印迹法分别 检测K562与K562TC细胞在无血清培养耐受性及Bcl-2蛋白表达水平方面的差异。 结 果:稳定表达mtCDase 的K562TC细胞Bcl-2蛋白水平明显升高，抗血清剥夺能力明 显增强。以硫代反义寡核苷酸特异性封闭K562TC细胞mtCDase，Bcl-2蛋白表达水平下调；二 甲基鞘氨醇（DMS，鞘氨醇激酶抑制剂，降低细胞内1-磷酸鞘氨醇水平）同样下调K562TC细 胞Bcl-2蛋白表达水平，而外源性1-磷酸鞘氨醇（SPP）显著上调K562细胞Bcl-2表达水平。 结论:mtCDase转染K562细胞导致Bcl-2蛋白表达水平升高及无血清培养耐 受能力增强。这种效应是通过mtCDase的下游代谢产物-SPP产生的。本研究证实mtCDase通过 其下游代谢产物代谢SPP，上调K562细胞Bcl-2蛋白表达水平。     

抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人木糖基转移酶（XT-I）蛋白的多克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位，从中选择优势抗原表位，通过引物优化设计，PCR拼接并扩增相应区域DNA片段，将其插入原核表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌ER2566，获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体，ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体，采用Westem blot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果：确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG（175-205）为抗原表位，成功构建了重组表达载体，表达融合蛋白GST-XT，并以其为抗原，免疫新西兰大白兔，制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1：640000：Western blot结果显示：该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论：获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体，为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。     

抗HIV p24和人A型红细胞双特异性单克隆抗体的研制

目的：制备抗HIV p24和人A型红细胞双特异性单抗(mAb)，并建立检测HIV p24的间接血凝试验。方法：将分泌抗HIV p2d mAb的杂交瘤株2-E4和分泌抗人A型红细胞mAb的杂交瘤株S2，分别用8-Ag和5-BrdU驯化，使成为HAT敏感株。将两者常规融合，筛选分泌双特异性mAb的杂交-杂交瘤株。然后制备并纯化双特异性mAb，用其建立的间接血凝法检测p24。结果：共获得6株杂交-杂交瘤细胞株，以其分泌的双特异性mAb建立了检测HIV p24的间接血凝法，敏感性可达400ng/L。结论：获得可稳定分泌双特异性mAb的杂交-杂交瘤株，并用纯化的双特异性mAb建立了快速检测HIV p24的间接血凝法。     

T、B细胞衰老及其分子机制研究进展

衰老是机体代谢过程中的一个必然阶段 ,主要表现为机体对环境刺激的适应能力减弱以至丧失 ,出现多种器官组织功能的衰退并影响健康。其中免疫衰老 (ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｅｓ ｃｅｎｃｅ)对机体的影响很大 ,表现为感染、肿瘤和自身免疫性疾病发生频率增加。衰老引起的免疫功能异常 ,最明显的是胸腺萎缩 ,继而可影响到Ｔ细胞的发育、不同表型和功能的Ｔ细胞比例失衡、Ｔ细胞活化、凋亡及其功能 ;同时也可影响到Ｂ细胞、ＮＫ细胞及单核细胞。本文就衰老对Ｔ细胞、Ｂ细胞免疫功能的影响及分子基础进行了综述。1　与年龄有关的胸腺退化和Ｔ细胞衰…