弓形虫感染对小鼠和人子宫自然杀伤细胞的影响

目的　观察弓形虫感染对小鼠和人子宫自然杀伤细胞（uterine natural killer cells, uNK cells）比例、数量、分化和功能的影响,探讨uNK细胞在弓形虫感染致早孕流产中的作用。方法　妊娠第6.5天给予孕鼠腹腔注射弓形虫速殖子,建立孕早期弓形虫感染致流产小鼠模型,妊娠第9.5天分离小鼠子宫淋巴细胞。取人正常妊娠孕早期流产新鲜蜕膜组织,分离人子宫淋巴细胞,与弓形虫RH株速殖子体外共培养48 h（弓形虫与子宫淋巴细胞比例分别为0.5∶1、1∶1、2∶1）。采用流式细胞术检测小鼠uNK细胞表型（CD122、NK1.1、DX5）、人uNK细胞表型（CD3、CD56、CD11b、CD27）及胞内细胞因子γ⁃干扰素（interferon⁃γ, IFN⁃γ）和肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α, TNF⁃α）表达水平。磁珠分选小鼠和人uNK细胞,以小鼠YAC⁃1或人K562细胞作为靶细胞、以小鼠或人uNK细胞作为效应细胞,采用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放法检测效应细胞/靶细胞比例分别为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时uNK细胞的杀伤功能。结果　妊娠第9.5天,弓形虫感染组小鼠流产率较对照组显著上升（83.02% vs. 3.51%;[χ2] = 71.359,P < 0.001）。与对照组比较,弓形虫感染组小鼠uNK细胞绝对数量显著降低[（4 547 ± 1 610）个/只 vs.（8 978 ± 3 339）个/只;U = 2.000,P < 0.05]、细胞表面NK1.1表达水平显著下降[（74.53 ± 8.37）% vs.（93.00 ± 1.11）%;U = 0.000,P < 0.05]、NK1.1⁃DX5⁃细胞比例显著上升[（20.10 ± 8.03）% vs.（5.04 ± 0.68）%;U = 0.000,P < 0.05]、NK1.1+DX5+细胞比例显著下降[（21.70 ± 12.48）% vs.（45.75 ± 2.26）%;U = 0.000,P < 0.05]、IFN⁃γ表达水平显著升高[（16.74 ± 1.36）% vs.（8.13 ± 1.90）%;U = 0.000,P < 0.05],但TNF⁃α表达水平无显著改变[（67.98 ± 9.20）% vs.（52.93 ± 10.42）%;U = 2.000,P > 0.05]。弓形虫感染组小鼠uNK细胞表现出较强杀伤能力,且杀伤作用随着效应细胞/靶细胞比例升高逐渐增强;效应细胞/靶细胞比例为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时,感染组uNK细胞对YAC⁃1细胞的杀伤活性分别为2.30%、4.32%、8.12%和12.65%,对照组分别为1.21%、1.63%、2.51%和3.22%。将人子宫淋巴细胞与弓形虫RH株速殖子共培养48 h后,弓形虫感染组人uNK细胞在子宫淋巴细胞中所占比例较对照组显著降低[弓形虫2∶1组 vs. 对照组：（6.61 ± 1.75）% vs.（17.48 ± 4.81）%;F = 7.307,P < 0.01]、绝对数量显著减少[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（12 104 ± 5 726）个/孔 vs.（65 285 ± 21 810）个/孔;H =11.540,P < 0.01]。弓形虫感染组uNK细胞中,CD56brightCD16⁃调节型NK细胞亚群比例较对照组减少（弓形虫2∶1组vs. 对照组：（25.25 ± 5.90）% vs.（36.03 ± 4.51）%;F = 3.213,P > 0.05]、CD56dimCD16+杀伤型NK细胞亚群比例增加[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（11.15 ± 2.15）% vs.（7.09 ± 2.24）%,F = 2.992,P > 0.05],两者比值显著降低[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（2.37 ± 0.92）vs.（5.58 ± 2.39）;H = 8.228,P < 0.05];CD11b+CD27⁃细胞比例显著上升[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（30.28 ± 6.91）% vs.（17.48 ± 4.67）%;H = 6.556,P < 0.05],IFN⁃γ [弓形虫2∶1组vs. 对照组：（14.13 ± 1.28）% vs.（15.19 ± 1.64）%;F = 1.639,P > 0.05]、TNF⁃α表达水平无显著改变[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（54.76 ± 10.02）% vs.（50.33 ±3.67）%;F = 0.415,P > 0.05]。弓形虫感染组人uNK细胞具有较强杀伤能力,且杀伤作用随着效应细胞/靶细胞比例升高逐渐增强;效应细胞/靶细胞比例为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时,感染组uNK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为11.90%、28.11%、49.91%和73.35%,对照组分别为11.21%、21.63%、33.51%和48.22%。结论　弓形虫感染对小鼠和人uNK细胞分化和分泌功能产生了不同影响,但均可引起小鼠和人uNK细胞绝对数量减少、杀伤功能增强。     

microRNA调控内耳发育及听力损失的研究进展

microRNA(miRNA)作为一类微小非编码RNA,通过RNA干扰(RNAi)信号通路来调控基因表达,在机体发育和疾病中发挥重要作用。基于此,本文一方面揭示miRNA在斑马鱼和小鼠的内耳发育过程中的表达状况和其重要作用,以此外推其在人类内耳中的功能;另一方面阐述了miRNA参与调控听力损失相关疾病表型中的最新进展,为探索如何更好地预防听力损失的发生及改善预后提供新的线索。     

三氧自体血回输在改善冠状动脉病变患者非心脏手术后心肌损伤中的作用

目的 探讨三氧自体血回输对冠状动脉病变患者非心脏手术后心肌损伤的影响.方法 选取择期行胃癌、肠癌、食管癌根治术患者90例,随机分为三氧治疗组(n=45)和对照组(n=45).三氧治疗组于手术当天及术后第1、2天行三氧自体血回输治疗,对照组仅行自体血回输.于麻醉前(T0)、术后6 h(T1)、术后12 h(T2)、术后24 h(T3)、术后48 h(T4)抽取静脉血,检测血浆中心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)含量.采用经胸超声测量三尖瓣前叶瓣环的移位(TAPSE)及左室射血分数(LVEF).记录术后24h血管活性药物分数(VIS)、C反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)和术中时间加权平均动脉压(TWA-MAP).结果 2组患者术后的cTnI、cTnT均有不同程度升高,与对照组比较,三氧治疗组T2、T3、T4时cTnI及cTnT表达减少,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组相比,三氧治疗组LVEF和TAPSE在T1、T2、T3时均增加,且术后24h的VIS分数降低,差异有统计学意义(P ＜0.05).与对照组相比,三氧治疗组患者术后24h的CRP及IL-6降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 三氧自体血回输可改善冠状动脉病变患者非心脏手术后的心肌损伤.     

霍奇金淋巴瘤化疗期间肝脏及纵隔血池18F⁃FDG的摄取变化

目的：探讨霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma,HL）患者接受阿霉素+博来霉素+长春花碱+氮烯咪胺（adriamycin,bleomycin,vinblastine and dacarbazine,ABVD）方案化疗时,肝脏及纵隔血池氟代脱氧葡萄糖（18F?fluorodeoxyglucose,18F?FDG）摄取的变化。方法：回顾性分析经病理确诊的41例HL患者的18F?FDG正电子发射计算机断层显像（positron emission tomography/computed tomography,PET/CT）资料,所有患者于ABVD方案化疗前（PET0）、化疗2周期（PET2）、化疗4周期（PET4）、化疗6周期（PET6）行18F?FDG PET/CT检查,分别测量PET0、PET2、PET4、PET6时的肝脏及纵隔血池的最大标准摄取值（SUVmax）和平均标准摄取值（SUVmean）。结果：PET2时肝脏SUVmax（3.42±1.04）和PET4时肝脏SUVmax（3.44±0.60）均明显高于PET0（2.96±0.75,P均＜0.05）和PET6时（3.13±0.58,P均＜0.05）;PET2时肝脏SUVmean（2.27±0.76）和PET4时肝脏SUVmean（2.24±0.45）也均明显高于PET0（1.84±0.40,P均＜0.05）和PET6时（1.93±0.38,P均＜0.05）。PET0、PET2、PET4、PET6时,各组纵隔血池的SUVmax和SUVmean均无统计学差异（均P＞0.05）。PET0时肝脏SUVmax与临床分期呈负相关（r=-0.637,P＜0.001）;而肝脏SUVmean、纵隔血池SUVmax、纵隔血池SUVmean均与临床分期无关（r=-0.286、-0.058、-0.004,P=0.070、0.717、0.979）。结论：HL化疗期间,患者肝脏的18F?FDG摄取会增高;化疗中期,PET/CT以肝脏的18F?FDG摄取作为参考,进行Deauville评分时,需考虑化疗药物对肝脏18F?FDG摄取的影响。     

雷帕霉素对肥胖小鼠卵巢功能的影响

目的：研究雷帕霉素对母源性肥胖导致的卵巢功能异常的干预作用以及药物的安全性评估。方法：建立一种高脂饮食的雌性肥胖小鼠模型,然后随机分为注射雷帕霉素的处理组和注射PBS的对照组,24周后统计其排卵数目,收集卵母细胞进行纺锤体免疫荧光染色,以评估雷帕霉素对肥胖小鼠排卵功能及卵母细胞质量的影响,并通过蛋白免疫印迹分析和RT?qPCR分析检测卵巢相关基因在蛋白和mRNA表达水平的变化。结果：雷帕霉素处理的肥胖小鼠体重下降,其卵巢磷酸化核糖体蛋白（phosphorylated ribosomal protein 6,P?rps6）和磷酸化起始因子4E结合蛋白（phosphorylated 4E binding protein 1,P?4EBP1）的表达明显降低,且超排的卵母细胞数目与对照相比有增加趋势,但卵母细胞纺锤体染色结果显示卵母细胞质量无明显差异;处理后的卵巢肿瘤坏死因子（tumor necrosis factorα,TNF?α）的mRNA表达水平增加;血清中雌激素和促卵泡激素都无明显变化。结论：雷帕霉素有改善排卵功能的趋势,尚未发现对卵母细胞质量有明显影响,为未来研究雷帕霉素对肥胖女性生育力的影响提供了实验基础。     

小RNA 2’⁃O⁃甲基转移酶Henmt1在小鼠精子发生中的作用

目的：通过构建基因突变小鼠模型,研究小RNA 2’?O?甲基转移酶Henmt1在小鼠精子发生中的作用。方法：利用CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR?associated protein 9）技术,构建Henmt1基因突变小鼠,通过计算机辅助精子分析、HE染色及免疫荧光检测等技术对小鼠表型进行分析。结果：成功构建Henmt1基因突变小鼠模型;生育力测试结果提示Henmt1基因突变雄鼠不育;Henmt1基因突变导致雄性小鼠精子发生阻滞;突变小鼠睾丸中逆转座子元件LINE1表达上调。结论：Henmt1对雄性小鼠精子发生有重要调控作用。     

CDCP1基因重组慢病毒表达载体的构建及其对宫颈癌细胞增殖与迁移的影响

目的: 构建含CUB结构域包含蛋白1（CUB domain containing protein 1,CDCP1）基因的重组慢病毒表达载体,研究CDCP1蛋白对宫颈癌细胞增殖与迁移的影响。方法: 以人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）cDNA为模板,采用PCR法扩增出CDCP1基因,将其克隆至pHAGE CMV MCS IzsGreen载体中,构建重组慢病毒表达载体pHAGE-CDCP1。将重组质粒pHAGE-CDCP1以及对照质粒pHAGE分别与包装质粒psPAX2以及包膜质粒pMD2.G共转染入人胚肾上皮细胞（293 T细胞）,48 h后收集病毒悬液,并采用梯度稀释法测定病毒滴度。将重组慢病毒CDCP1感染人宫颈癌HeLa细胞,通过免疫印迹法检测CDCP1蛋白的表达,采用CCK-8实验检测过表达 CDCP1对 HeLa 细胞增殖的影响;采用划痕实验和Transwell细胞迁移实验观察过表达CDCP1对HeLa细胞迁移能力的影响。结果： 质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pHAGE-CDCP1构建成功。重组pHAGE-CDCP1慢病毒感染宫颈癌HeLa细胞后细胞状态良好,CDCP1蛋白表达水平明显增加。高表达CDCP1可以显著提高HeLa 细胞的增殖和迁移能力。结论： 过表达CDCP1能够促进宫颈癌 HeLa 细胞的增殖和迁移。     

流式细胞术检测细胞周期实验条件的影响因素分析

［摘要］目的: 研究流式细胞术检测细胞周期的各个实验环节对结果的影响。方法: 应用流式细胞术检测经秋水仙素刺激后的人结肠癌细胞株,分析细胞周期的固定方式、细胞数量、固定温度、固定时间以及染色时间等环节对结果的影响。结果： 用PBS吹散后经纯乙醇固定的效果最佳;细胞数太多或太少时,影响检测结果和曲线的平滑程度,且变异系数（coefficient of variation,CV）值增大;固定后放置于常温影响检测结果,置于4℃或-20℃没有显著差异;固定后-20℃放置70 d内检测结果无明显差异;染色完成后2 h内检测结果无明显差异。结论： 1×106细胞沉淀用PBS吹散后经纯乙醇固定,放置于-20 ℃,70 d内检测,染色后2 h之内完成检测。     

HEV保护性基因工程抗体的制备及功能研究

目的：制备抗戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）的人鼠嵌合基因工程抗体并研究其中和保护作用及特性。方法：将已获得的抗HEV鼠源单克隆抗体基因序列进行优化,设计人鼠嵌合的工程化抗体基因序列,将其克隆入真核表达载体;表达载体共转染293F细胞进行表达优化,高效制备基因工程化抗体;通过酶联免疫反应（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、免疫荧光及HEV细胞感染模型,研究工程化抗体的结合能力及中和活性。结果：成功构建基因工程化人鼠嵌合HEV保护性抗体表达载体,在293F表达系统中实现高效表达。抗体表达产率达30 mg/L,亲和力为1.202×10-8 mol/L。免疫荧光检测结果显示抗体能够灵敏、特异地与已感染HEV的 Kernow细胞结合,实时荧光定量PCR检测结果显示抗体可保护易感的C3A细胞不被HEV感染。结论：基因工程化抗体抗体具有高效的HEV结合能力及中和作用,能有效阻断HEV感染,并实现低成本高效表达。     

大数据时代的临床医学研究——机遇和挑战

临床医学研究是医学发展的核心驱动力。在大数据背景下,国家高度重视、重点支持,通过顶层设计为我国临床医学研究提供制度保障和资源支撑。多组学与信息技术的飞速发展,为我国临床医学研究提供了宝贵的资源,助力临床医学研究内容的持续创新,催化临床诊疗模式的不断变革,我国临床医学研究正面临新的机遇。然而,目前我国生物医学大数据还存在存储碎片化、数据交汇机制缺乏等问题,亟需建立政府主导的数据共享机制,寻求通力合作的研究模式。在新的时代背景下,依托大数据的真实世界研究将逐渐成为临床干预的重要证据来源,我们要加强临床数据资源和生物样本资源的积累,创新研究方法,打破传统思维模式,迎接新的机遇与挑战。