Rapid and High-throughout Identification of Recombinant Bacteria with Mass Spectrometry Assay

Objective To construct a rapid and high-throughput assay for identifying recombinant bacteria based on mass spectrometry. Methods Matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） techniques were used to identify 12 recombinant proteins （10 of Yersinia pestis, 1 of Campylobacter jejuni and 1 of Helicobacter pylori）. A classification model for the various phase of recombinant bacteria was established, optimized and validated, using MALDI-TOF MS-CIinProTools system. The differences in the peptide mass spectra were analyzed by using Biotyper and FIexAnalysis softwares. Results Models of GA, SNN, and QC were established. After optimizing the parameters, the GA recognition model showed good classification capabilities： RC=100%, mean CVA=98.7% （the CVA was 96.4% in phase 1, 100% in phase 2, 98.4% in phase 3, and 100% in phase 4, respectively） and PPV=95}. This model can be used to classify the bacteria and their recombinant, which only requires 3.7x103 cells for analysis. The total time needed is only 10 min from protein extraction to reporting the result for one sample. Furthermore, this assay can automatically detect and test 96 samples concurrently. A total of 48 specific peaks （9, 16, 9, and 14 for the four stages, respectively） was found in the various phase of recombinant bacteria. Conclusion MALDI-TOF MS can be used as a fast, accurate, and high-throughput method to identify recombinant bacteria, which provide a new ideas not only for recombinant bacteria but also for the identification of mutant strains and bioterrorism pathogens.     

云南华坪县与攀枝花市交界地小型兽类及其寄生蚤群落结构分析

目的 调查华坪县与攀枝花市交界地区小型兽类（小兽）及其寄生蚤的组成和分布,为鼠疫防控提供依据。方法 以华坪县与攀枝花市交界3个乡镇海拔1 000~2 250 m的农耕区和居民区2种生态环境为调查空间范围,采用夹夜法和笼夜法捕获小兽,梳捡体表寄生蚤,分类计数,运用群落生态学指标进行群落结构和物种多样性分析。结果 共捕获小兽3 目4 科9 属17 种240只,主要是啮齿动物187只（占77.92%）,其次是食虫动物51只（占21.25%）,居民区小兽捕获率为1.58%,以小家鼠占47.37%（9/19）和褐家鼠占26.32% （5/19）为主要优势种;农耕区小兽捕获率为10.85%,以卡氏小鼠（23.08%）、斯氏家鼠（12.22%）、灰麝鼩（11.76%）、长尾大麝鼩（11.31%）、锡金小鼠（10.41%）和齐氏姬鼠（10.41%）相对较多。1 000~1 500 m低海拔地区以啮齿动物小鼠属和食虫动物麝鼩属为主,随海拔升高至2 000 m以上,啮齿动物姬鼠属和绒鼠属相对优势度增加。检获小兽寄生蚤5科7属7种26匹,居民区缓慢细蚤和印鼠客蚤相对较多,农耕区近端远棒蚤二刺亚种、穗缘端蚤中缅亚种和方叶栉眼蚤相对较多,小兽平均染蚤率为7.08%,总蚤指数为1.53。小兽及其寄生蚤的物种丰富度、多样性指数和均匀度指数农耕区比居民区高,反之优势度居民区高于农耕区,居民区与农耕区之间小兽群落相似性极为不相似;不同海拔带中小兽及其寄生蚤群落生态学指标无明显区别,不同海拔带之间小兽群落相似性为中等相似。结论 华坪县与攀枝花市交界地区有家、野两型疫源地的主要宿主和媒介分布,具有鼠疫的宿主和媒介基础,但总体上鼠密度和蚤指数相对不高,可认为干热河谷地区鼠疫风险不高,有待加强鼠传疾病及其宿主媒介的监测。     

云南省巧家县鼠疫疫源地调查及流行风险分析

目的 对金沙江流域云南省巧家县开展鼠疫疫源地调查,了解鼠疫宿主媒介组成及动物间鼠疫流行情况,探讨鼠疫发生和流行风险,为该地区鼠疫监测防控提供科学依据。方法 在巧家县辖区选取7个乡镇为调查范围,采用笼夜法和夹线法调查小型兽类及其体表寄生蚤,采集宿主动物脏器、血清及其体表寄生蚤样本,同时现场采集鼠疫指示动物血清,对采集到的宿主动物脏器和蚤样本进行鼠疫菌培养检测,采用间接血凝实验（IHA）对宿主动物和指示动物血清样本进行鼠疫F1抗体检测。结果 共捕获小型兽类（小兽）3目6科12属23种525只,农耕区优势种群为齐氏姬鼠（31.05%）、北社鼠（13.90%）和微尾鼩（11.43%）,居民区优势种群为褐家鼠（66.67%）和黄胸鼠（20.00%）;农耕区和居民区鼠密度分别为20.98%和1.00%。捡获小兽体外寄生蚤5科13属15种277匹,优势种群为偏远古蚤（22.02%）、特新蚤指名亚种（20.58%）、迪庆额蚤（18.77%）和方叶栉眼蚤（11.55%）,鼠体蚤指数为0.53。采集全部鼠类脏器和蚤类样本均未分离到鼠疫菌。采集犬血清167份和鼠血清15份,IHA检测鼠疫F1抗体均为阴性。结论 巧家县有鼠疫主要宿主和主要媒介分布,鼠密度较高,鼠体蚤指数较低。鼠疫宿主动物、媒介蚤类和指示动物均未检测出阳性,可认为近期该地区鼠疫发生和流行的风险不高,有必要进一步加强该地区鼠疫等鼠传疾病的监测防控。     

应用3种方法检测鼠疫恢复期患者血清中F1抗体水平

目的 了解鼠疫恢复期患者血清F1抗体水平的维持情况及间接血凝、酶联免疫、胶体金免疫层析技术在鼠疫F1抗体检测中的应用。 方法 应用间接血凝试验(IHA)、双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgs-ELISA)和胶体金免疫层析试验(GⅠCA)3种方法,对比检测25例鼠疫恢复期患者血清中F1抗体。 结果 25份血清样品F1抗体IHA阳性19份,DAgs-ELISA阳性21份,GⅠCA阳性18份。F1抗体滴度:IHA 15例为1∶80~1∶320;ELISA 10例为1∶640~1∶1280。 结论 大部分鼠疫恢复期患者血清能检出F1抗体,3种F1抗体检测方法均为敏感、特异的检测技术。     

分子生物学方法鉴定由自毙鼠分离的细菌

目的 对1株由自毙鼠分离的细菌（X175菌株）进行属、种及型的鉴定。方法 ①采用16S rDNA对X175菌株进行种属鉴定;②应用荧光PCR检测X175菌株是否存在致泻性大肠埃希菌常见毒素基因（stx1/stx2/eae、lt/st、aggR/ipaH）及大肠埃希菌O104、H4基因;③应用PCR检测X175菌株是否存在肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O104∶H4的9个毒力基因。结果 ①经16S rDNA鉴定,X175菌株与大肠埃希菌埃希菌属的一些菌株相似度达99%,进化树显示X175菌株与大肠埃希菌O104∶H4菌株的亲缘关系较近;②大肠埃希菌O104基因和ipaH基因检测结果均为阳性,stx1/stx2/eae、lt/st、aggR、志贺菌/沙门菌、H4等基因检测结果均为阴性;③肠出血性大肠埃希菌O104∶H4九个毒力因子检测结果均为阴性。结论 X175菌株为大肠埃希菌O104弱毒型菌株,H抗原和其他一些特性还需进一步研究。     

云南省鼠疫菌Fse I酶切分型及其流行病学意义

目的　构建云南省鼠疫菌Fse I酶切的脉冲场凝胶电泳（PFGE）图谱库并探讨其流行病学意义。方法　采用限制性内切酶Fse I对云南家、野鼠型及丽江玉龙鼠疫菌株进行酶切分析,并聚类分析电泳图谱。结果　30株被试菌株分为16种PFGE型别,其相似性系数为79．8％～100．0％;16种PFGE基因型可以分为4个簇,除EV76自成一簇,其余3个簇分别为家鼠型基因簇、野鼠型基因簇及玉龙基因簇。结论　云南省鼠疫菌PFOE基因型与生态型、生物型相吻合,具有一定的区域聚集性,而丽江玉龙鼠疫菌为一个独立基因簇。     

香格里拉县喜马拉雅旱獭及其寄生蚤分布调查研究

目的了解云南省香格里拉地区喜马拉雅旱獭及其寄生蚤的分布情况，为鼠疫及相关疾病防治研究积累基础资料。方法通过野外现场调查确定喜马拉雅旱獭在香格里拉县的分布范围、分布特点、种群、数量；利用圈套、挖洞等方法捕获旱獭，检体表寄生蚤及洞干蚤，进行生态学研究。结果海拔2300～4900m的7个乡（镇），调查24个点，确认16个点有旱獭分布，在7个旱獭分布点捕获旱獭22只，均为喜马拉雅旱獭（Marmota himalayana）；检获獭体寄生蚤56只，属1科1亚科3属3种，分别为斧形盖蚤（Callopsylla dolabris）、谢氏山蚤（Oropsylla silantiewi）、二刺形大锥蚤（Macrostylophora bispiniforma）；获洞干蚤7只，分属2科2亚科4属4种，分别为斧形盖蚤、谢氏山蚤、双凹纤蚤（Rhadinopsylla biconcava）和扇形巨槽蚤（Megabothris rhipisoides）。结论香格里拉县北部有喜马拉雅旱獭分布，斧形盖蚤和谢氏山蚤是该地优势蚤种；该地区高山草甸生境与周边喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地的生态环境相似，同时存在喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地的主要宿主及主要传播媒介，提示香格里拉县具备喜马拉雅旱獭型鼠疫的宿主、媒介和自然地理条件。     

云南玉龙鼠疫疫源地宿主动物群落结构特征及其流行病学意义

目的 探讨玉龙鼠疫自然疫源地宿主动物的群落结构和分布格局与动物鼠疫流行的关系。方法 在丽江玉龙鼠疫自然疫源地核心区4个海拔带内选择林地和耕地2种生境,于2015年每季度对小型兽类开展群落生态学调查,测算小兽群落生态学指标,分析小兽群落空间分布和季节变化,并运用描述流行病学方法分析动物鼠疫流行特征。结果 共捕获小兽1 575只隶属于4目6科12属22种,平均捕获率为19.84%,齐氏姬鼠、大绒鼠和中华姬鼠为群落的优势种,构成比分别为44.19%、19.37%和14.35%;不同生境、不同垂直梯度、不同季节之间,捕获率差别均有统计学意义,耕地中小兽密度高于林地,IV垂直带(3 100 m~)耕地和春季耕地的捕获率为最高,分别为40.12%和27.85%;林地小兽物种多样性和均匀度较耕地高,生态优势度较耕地低,小兽物种多样性和均匀度随垂直梯度的升高呈下降趋势,随春-夏-秋-冬季节变化呈上升趋势,而生态优势度则相反;不同垂直带两种生境之间丰富度、多样性和优势度差别均无统计学意义,不同季节两种生境之间多样性、均匀度和优势度差别均具有统计学意义。疫源地既往动物鼠疫流行高发季节为春末夏初的4-5月,疫点分布以IV垂直带(3 100 m~)农耕区为主。结论 玉龙鼠疫自然疫源地小兽具有相对复杂的群落结构,在不同季节、生境和垂直梯度条件下的生态分布格局存在一定异质性,并与当地鼠疫流行特征具有重要关系。     

云南香格里拉县不同生境小型兽类群落多样性特征

目的研究香格里拉县小型兽类动物群落结构及多样性特征。方法用群落生态学方法计算群落结构、多样性和相似性指数。结果2011年6～7月,在该地区4类不同生态环境中,捕获小型兽类425只,包括4目7科14属21种;多样性分析结果表明,4种不同生境的Shannon．Winner多样性指数0．3857～1．9537,Pielou均匀度指数0．5564～0．7862,Simpson优势度指数O．1809—0．7743,Margalef丰富度指数0．0501。2．3938;Whittaker群落相似性指数显示,林区与农耕地生境小兽群落相似性相对较高,居民区和高山灌丛草甸小兽群落完全不同。结论香格里拉县小型兽类群落物种组成和多样性因生境条件的差异而不同,多样性以林区生境最高,高山灌丛草甸次之,农耕地及居民区较低。