假结核耶尔森菌毒力相关基因的检测及序列分析

目的对来自不同血清型的29株假结核耶尔森菌的主要毒力相关基因进行检测及序列分析,初步了解假结核耶尔森菌主要毒力基因的分布与变异情况。 方法应用的聚合酶链反应（PCR）技术进行血清学分型与毒力基因（inv、pYV、HPI毒力岛、ypm）检测,并对ypm基因扩增基因进行测序比较。 结果29株实验菌株均携带编码侵袭素的inv基因,15株携带毒力质粒（pYV）,13株携带全部或部分HPIs基因簇,19株携带ypmA基因,1株携带ypmB基因,1株携带ypmC基因 。结论假结核耶尔森菌毒力基因的分布具有一定的多态性。     

布鲁氏菌微滴式数字PCR方法的建立与应用

目的 建立可对布鲁氏菌准确定量的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法.方法 使用以布鲁氏菌bscp 31基因为靶标的引物和探针,摸索最佳的引物和探针工作浓度,确定反应体系和扩增条件,评价所建立方法的灵敏性、特异性及对疫情相关血液标本的检测效果.结果 ddPCR反应体系中最佳引物和探...     

Immunogenicity and therapeutic effects of recombinant Ag85AB fusion protein vaccines in mice infected with Mycobacterium tuberculosis

The immune function of tuberculosis (TB) patients is disordered. By using immune regulators to assist chemotherapy for TB the curative effect might be improved. In this study, a vaccine containing Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) recombinant Ag85AB fusion protein (rAg85AB) was constructed and evaluated. The mice were immunized intramuscularly three times at two-week intervals with Ag85AB fusion protein combined with Corynebacterium parvum adjuvant (rAg85AB+CP). In comparison to control mice that received either CP alone or saline, the mice that received rAg85AB+CP had significantly higher number of T cells secreting IFN-γ and higher levels of specific antibodies of IgG, IgG1 and IgG2a isotypes in sera. The specific antibodies also had higher ratios of IgG2a to IgG1, indicating a predominant Th1 immune response. To test for immunotherapy of TB, M. tuberculosis infected mice were given three intramuscular doses of 20 μg, 40 μg or 60 μg of rAg85AB in rAg85AB+CP, or phosphate-buffered saline (PBS), or CP or Mycobacterium phlei (M. Phlei) F.U.36. Compared with the PBS group, 20 µg, 40 µg and 60 µg rAg85AB+CP and M. phlei F.U.36 groups reduced the pulmonary bacterial loads by 0.13, 0.15, 0.42 and 0.40 log₁₀, and the liver bacterial loads by 0.64, 0.64, 0.53 and 0.61 log₁₀, respectively. Pathological changes of lungs were less, and the lesions were limited to a certain extent in 40 µg and 60 µg rAg85AB+CP and M. phlei F.U.36 groups. These results showed that rAg85AB+CP had immunotherapeutic effect on TB, significantly increasing the cellular immune response, and inhibiting the growth of M. tuberculosis.     

Determination of relationships among non-toxigenic Vibrio cholerae O1 biotype El Tor strains from housekeeping gene sequences and ribotype patterns

Sequencing of three housekeeping genes, mdh, dnaE and recA, and ribotyping for seven non-toxigenic Vibrio cholerae O1 strains isolated from different geographic sources indicate a phylogenetic relationship among the strains. Results of MLST and ribotyping indicate a clear difference between three toxigenic strains (N16961, O395, and 569B) and three non-toxigenic strains from India (GS1, GS2, and GW87) and one Guam strain (X392), the latter of which were similar in both MLST and ribotyping, while two other non-toxigenic strains from the USA and India (2740-80 and OR69) appeared to be more closely related to toxigenic strains than to non-toxigenic strains, although this was not supported by ribotyping. These results provide clues to the emergence of toxigenic strains from a non-toxigenic progenitor by acquisition of virulence gene clusters. Results of split decomposition analysis suggest that widespread recombination occurs among the three housekeeping genes and that recombination plays an important role in the emergence of toxigenic strains of V. cholerae O1.     

天津市蓟县地区莱姆病螺旋体主要生物媒介的调查研究

目的了解当地莱姆病的主要生物媒介一蜱的种类、带菌状况以及在传播莱姆病中的作用。方法采用布旗法及动物诱捕法在山林地区采集蜱。对蜱种进行鉴定。并进行病原分离培养和PCR检测。结果共收集到1226只蜱，经鉴定属于硬蜱科中2属2种：硬蜱届的全沟硬蜱和血蜱属的长角血蜱。其中以长角血蜱为优势种，构成比占92．58％（1135／1226）；随机对300只长角血蜱进行针对莱姆病螺旋体的PCR．检测，有14只阳性，阳性率为4．67％。并对其余926只蜱进行病原分离培养，未得到莱姆病螺旋体。结论血蜱可能是天津蓟县地区莱姆病传播的主要生物媒介。     

扩增片段长度多态性分析用于霍乱弧菌分子分型的方法建立和应用评价

目的建立霍乱弧菌的基于红外荧光标记引物的扩增片段长度多态性(AFLP)分型方法,评价脉冲场凝胶电泳(PFGE)和AFLP对霍乱弧菌的分型能力。方法选择PFGE带型均不相同的47株霍乱弧菌作为评价菌株,建立AFLP对于霍乱弧菌的分型方法;确定操作程序后选择83株分离自1962-2005年11个省的霍乱弧菌,进行AFLP和PFGE对于霍乱弧菌分型能力的比较。AFLP分型方法采用了红外荧光标记PCR引物,利用LI-COR4300自动测序仪完成电泳、SagaMX软件对电泳图谱进行编辑。PFGE采用PulseNet提供的标准化程序。结果AFLP用于霍乱弧菌分型时选择性引物携带碱基数为1,最优引物组合为EcoRⅠ-G／MseⅠ-T,AFLP分型实验的重复性达到99．2％。AFLP将83株霍乱弧菌分为52个型别,D值为0．9545;PFGE将此83株菌分为44种带型,D值为0．9251。结论优化固定了AFLP对于霍乱弧菌的分型程序,重复性好;AFLP比PFGE具有更好的分型能力,能够用于分离菌株的分子分型。结合已成为实验室网络监测标准分析方法的PFGE,可对分离株做更细致的分型比较。     

中国八省市食品来源单核细胞增生李斯特菌的脉冲场凝胶电泳分析

目的 采用国际标准化的脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析方法对单核细胞增生李斯特菌（Lm）进行基因分型,初步建立中国Lm的基因分型数据库。方法 按照标准化的Lm-PFGE方法对来自国内8个省市、多种食品来源的118株Lm进行了PFGE分型。结果 118株Lm分成了39种带型,其中GX6A160004型有37株菌,占分析菌株的31．36%,是主要型别。结论 初步建立了中国单核细胞增生李斯特菌用于网络监测分析（PulseNet China）的基础数据库,发现同型菌株在全国多个地区广泛存在。     

实时聚合酶链反应检测O1群和O139群霍乱弧菌方法的建立及应用

目的建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应（RT—PCR）方法并进行水体标本的检测评价。方法根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列设计引物，利用SYBRGreen染料，建立同时检测霍乱弧菌O1群和O139群的RT—PCR方法，对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度、特异性及重复性评价。采集河口水标本增菌后进行RT—PCR检测，与分离培养方法比较评价实际应用价值。结果建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重RT—PCR方法，根据扩增产物的溶解温度能有效区分O1群和O139群霍乱弧菌两种目标片段的扩增；对其他10种弧菌染色体DNA没有扩增；RT—PCR检测524份河口水体标本的增菌液，与常规分离方法相比显示了明显的灵敏性，并且所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性。结论以O1群和O139群rfb基因为目标检测片段建立的霍乱弧菌RT—PCR方法可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查。     

浙江省温州市啮齿动物中汉坦病毒的分子流行病学研究

目的 研究浙江省温州市啮齿动物中汉坦病毒(HV)流行情况及病毒型别,为该地区肾综合征出血热(HFRS)的预防控制提供科学依据.方法 采用间接免疫荧光法(IFA)检测鼠肺中HV抗原;用RT-PCR法扩增阳性样品中HV的部分S片段及部分M片段;构建系统发生树进行系统发生分析及分型.结果在温州市HFRS疫区共捕获啮齿动物96只,在6份鼠肺样品中检测到HV抗原,其中4只褐家鼠,1只黄胸鼠与1只黄毛鼠,病毒携带率为6.3%.用汉城病毒(SEOV)特异引物从其中5份HV抗原阳性样品中扩增出部分S片段(620～999nt)及部分M片段(2001～2301nt)并测定序列.对扩增出的部分S及M片段的核苷酸序列分析发现,5株病毒与现有的SEOV有高同源性,均为汉城型HV.但在用部分S片段及部分M片段核苷酸序列所构建的系统进化树上,5株病毒的聚集模式不同.结论温州市的褐家鼠、黄胸鼠、黄毛鼠均携带汉城型HV,并可能发生基因片段的重排.     

河南省两株狂犬病毒核蛋白和糖蛋白基因的序列分析

目的分析河南省2株狂犬病毒核蛋白及糖蛋白的基因序列,了解狂犬病毒街毒株与人用及兽用狂犬病疫苗株间的差异。方法以免疫荧光法检测2004年采自河南省的100只犬脑标本,取阳性犬脑组织悬液接种鼠脑分离病毒。以RT-PCR法扩增病毒核蛋白及糖蛋白全基因,克隆测序后进行遗传学分析。结果分离到2株狂犬病毒,分别命名为Henan Hb1与Henan Sq1,序列分析表明2株病毒均为基因1型狂犬病毒,2株病毒的N基因与G基因核苷酸的同源性分别为99.3%和98.9%,氨基酸的同源性分别为98.7%和98.4%。2株病毒与CTN疫苗株同源性较高,N基因与G基因的核苷酸同源性分别为89.1%和85.6%～85.7%,氨基酸同源性分别为97.6%～98.0%和92.3%。与已知的基因1型狂犬病毒相比,2株病毒与印度尼西亚从犬中分离到的2株病毒同源性最高,N基因与G基因核苷酸同源性分别为92.1%～93.2%和91.9%～92.1%,氨基酸同源性分别为97.5%～98.6%和96.0%～96.2%。Henan Sq1株病毒在糖蛋白关键的毒力位点333位由W替换了R。系统发育分析表明Henan Hb1与Henan Sq1与印度尼西亚株、疫苗株CTN、中国分离株,以及泰国与马来西亚分离株进化关系最近,而与疫苗株3aG、PV、ERA及攻击毒CVS株等进化关系较远。结论2株狂犬病毒是基因1型狂犬病毒,但无论是N基因还是G基因的核苷酸序列,以及推导出来的氨基酸序列与已知的1型狂犬病毒株及疫苗株均有一定的差异。