浙江省蚊媒携带流行性乙型脑炎病毒的分布特点

目的 了解浙江部分地区蚊媒及猪携带流行性乙型脑炎(乙脑)病毒情况以及浙江省存在的乙脑病毒基因型别.方法 于2007年5月至10月在浙江省仙居、龙泉和慈溪3个县人房及猪舍采集蚊虫标本和猪血清,共采集10 662只蚊虫和204份猪血清,蚊虫标本中以淡色库蚊和中华按蚊为主.利用病毒分离和荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测蚊虫携带乙脑病毒,应用酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)方法对猪血清进行抗体检测.应用荧光定量RT-PCR方法对细胞分离株进行病毒鉴定;利用RT-PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM基因,并对细胞分离到的病毒进行基因分型.结果 在蚊虫标本中检出7批乙脑病毒核酸阳性样本,并分离出3株病毒,经鉴定3株病毒均为乙脑病毒,基因分析表明3株病毒均属于基因Ⅰ型乙脑病毒.猪血清有121份阳性,总阳性率为59.3%.6月份有50%以上的猪血清中乙脑病毒抗体呈阳性.结论 浙江省部分地区存在着乙脑的传播媒介,在蚊媒和猪中携带有乙脑病毒;采集的蚊虫标本中分离到3株病毒,经鉴定为基因Ⅰ型乙脑病毒,是近年来在浙江省首次分离到的基因Ⅰ型乙脑病毒.     

汉坦病毒Z10疫苗株M片段的克隆及在昆虫细胞表达的研究

汉坦病毒 (HTNV)Z10株是从患者血清中分离到[1] ,现已用于生产肾综合征出血热 (HFRS)Ⅰ型疫苗的毒株。自 1995年投产供应市场后 ,已在全国二十几个省市推广应用 ,目前该疫苗已接种 10 0 0余万人份 ,为控制HFRS的流行起了很好的作用。我们应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法成功地扩增出Z10株全长M基因 ,进行核苷酸序列测定 ,并与HTN型及SEO型病毒的核苷酸序列进行比较 ,从分子水平证实它与HTN血清型病毒具有很高的同源性。将M基因插入重组杆状病毒 ,感染昆虫细胞 ,成功地表达了M基因膜蛋白 ,为进一步开发基因工程疫苗打下…     

东南沿海地区汉坦病毒的遗传进化分析

目的 对浙江、福建省及上海市东南沿海地区汉坦病毒的基因进行比较.方法 收集浙江、福建省及上海市汉坦病毒部分M基因序列,应用Mega 4.0和DNAStar软件包进行系统发生分析,以邻位相连法(NJ)构建系统发生树,分析东南沿海地区浙江、福建省及上海市汉坦病毒的基因差异,分析采用1000个多序列组.结果 经对浙江、福建省及上海市若干株汉坦病毒基因的序列比较与系统进化分析,浙江省分离的同型别毒株的基因序列同源性高于福建省与上海市的分离毒株,而浙江省同地区分离株的核苷酸同源性更高,地区接近的分离株系统进化分支的分布也大部分更靠近.汉滩型病毒(HTNV)福建株的ZH53和汉城型病毒(SEOV)浙江建德株Gou3和ZJ5与本研究同型别的其他株及国际标准株的核苷酸同源性较低,分别为82.7％～86.3％和84.0％～85.3％,而且分别在HTNV和SEOV发生群中构成一独立分支.浙江省从田鼠中分离到SEOV,产生宿主“溢出”现象.结论 浙江、福建省及上海市东南沿海地区汉坦病毒的基因差异和亲缘远近关系主要表现在地区性,显示出高度的地理聚集现象,浙江省建德地区和福建省分别存在SEOV和HTNV的特殊亚型病毒.     

汉坦病毒部分S基因在毕赤酵母中的分泌表达

目的 构建并表达汉坦病毒(HV)Z10株(HV-Z10)S基因蛋白编码区前300 bp核苷酸序列,研究该基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其产物的生物活性.方法 根据HV-Z10 S基因前300 bp(S300)的核苷酸序列,按照编码氨基酸的密码子转换成酵母偏爱的形式,设计合成8条引物,通过连续PCR,获得人工合成Z10株S基因前300 bp的基因序列SP300,经测序,SP300与S300的核苷酸相似性为76.2%,但编码的氨基酸序列完全一致.将SP300克隆到酵母穿梭载体pPICZaA,构建含α-factor分沁信号肽的重组表达载体pPICZaA-SP300.将pPICZaA-SP300、pPICZaA-S300化学法转化酵母GS115菌株,筛选重组转化子.结果 重组了SP300与S300的酵母转化子经甲醇诱导,表达出重组蛋白rNP300及rN300,SDS-PAGE显示相对分子质量为12×10~3左右.经ELISA检测及Westem Blot分析,表达产物能与抗汉坦病毒抗体起免疫反应.结论 SP300和S300基因在毕赤酵母中获得分泌表达,使用酵母偏爱密码子的SP300基因在毕赤酵母中的表达量与S300的表达量基本一致,表达量在诱导24 h后最高.     

2005 - 2017年邻近5省肾综合征出血热病毒演变规律与病原分子进化研究

目的 探索江苏、安徽、江西、浙江、福建这5个地理相邻的省份中重要虫媒传染病肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）的病毒演化关系,为HFRS的预防提供理论依据。方法 根据以往疫情资料和疫区类型在这5省中选择14个HFRS疫区,应用分子流行病学方法全面、系统的研究该病的流行特征、时空演变规律和宿主与病原共进化关系等。结果 5个省份在地理上邻近,气候上属于亚热带和温带的过渡地区,为病毒宿主提供了良好的繁衍条件。黑线姬鼠和褐家鼠分别为汉坦病毒在野外和室内的主要传染源。通过构建系统发生树进行分析发现,从疫区鼠中分离的汉坦病毒（hantavirus,HV）基因与现有病毒有高度的同源性;研究HV基因时空演变规律与病原分子进化发现,汉滩型病毒（hantaan virus, HTNV）和汉城型病毒（seoul virus, SEOV）的基因差异和亲缘性主要表现为地区性。结论 江苏、安徽、江西、浙江、福建地区仍是肾综合征出血热汉滩型和汉城型的主要混合疫区,该研究结果可为我国丘陵地区的肾综合征出血热流行趋势预测及预防提供理论依据。     

自制汉坦病毒N蛋白IgM直接捕捉ELISA诊断试剂盒的初步评价

目的初步评价应用自制辣根过氧化物酶（HRP）标记汉坦病毒（HV）重组N蛋白（rNP）的rNP-IgM直接捕捉ELISA诊断试剂盒。方法考核该试剂盒的特异性和稳定性;比较其与同类商品试剂盒的临床检测结果,以评估检测血清抗HV-IgM的敏感性。结果（1）该试剂盒仅与抗HV-IgM阳性血清发生反应,而与抗水痘病毒-IgM（抗VZV-IgM）、抗流行性乙型脑炎病毒-IgM（抗JEV-IgM）、抗登革热病毒-IgM（抗DV-IgM）、抗手足口EV71病毒-IgM（抗EV71-IgM）阳性血清均无反应;试剂盒放置37℃3d,检测血清抗HV-IgM的活性,无明显降低。（2）在120例临床疑似肾综合征出血热的144份血清中,2种试剂盒仅对12例的12份血清抗HV-IgM检测结果不一致,其中8例的首份血清,该试剂盒阳性,商品试剂盒阴性（第2份血清2种试剂盒均阳性）;3例的首份血清（未采到第2份血清）,该试剂盒为临界值,商品试剂盒阴性;另1例的首份血清该试剂盒阳性,商品试剂盒阴性（2种试剂盒第2份血清和第3份血清均阳性）。结论实验室研制的捕获法ELISA抗HV-IgM诊断试剂盒具有良好的特异性、稳定性和敏感性,适于HV感染的临床诊断和流行病学监测。     

人用流感禽流感联合疫苗的研究

目的了解人流感疫苗和H5N1禽流感疫苗联合后的安全性和疫苗之间产生抗体的相互干扰现象。方法制成禽流感单价疫苗、人流感3价疫苗和流感禽流感联合4价疫苗,免疫家兔,测定中和抗体和血凝抑制抗体,并接种小鼠和豚鼠,观察毒性反应和过敏反应。结果人流感疫苗和禽流感疫苗的联合,基本上没有发生疫苗对各自抗体产生的干扰;接种动物无毒性反应。结论 2种疫苗的联合是完全可能的。     

汉坦病毒Z5株M和S片段全基因序列测定及分析

目的测定汉坦病毒Z5株M、S片段的全长序列,了解其分子结构特征,并分析Z5与其他汉坦病毒株的遗传学差异。方法设计引物,用RT-PCR技术扩增Z5株全长M与S片段。PCR产物纯化后克隆入T载体并测定序列及分析。结果Z5株M片段的全基因序列含有3 616个核苷酸,编码1 135个氨基酸。S全基因序列含有1 700个核苷酸,编码429个氨基酸。经核苷酸与氨基酸同源性分析,Z5株应属于汉坦病毒的汉滩型(HTN型)毒株,与Z10株同属一个亚型。结论Z5株病毒和其他汉滩病毒病毒在核苷酸序列上有差异,但在氨基酸水平上的同源性仍较高。     

浙江省基因Ⅰ型乙脑病毒全基因序列的测定及分析

目的 为了获得浙江省乙脑病毒基因组详尽的资料,研究基因Ⅰ型乙脑病毒的分子特征及变异程度,为乙脑病毒分子流行病学及其基因研究提供科学依据.方法 设计特异性引物、RT-PCR分段扩增XJ69和XJP613株全基因,PER产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定.通过生物学软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析.结果 新分离乙脑病毒XJ69和NJP613株全基因组全长均为10 964个核苷酸,含有一个开放阅读框架,编码3432个氨基酸.与GenBank中选择的32株乙脑病毒全基因序列比较发现,其核苷酸同源为83.5%～99.2%,氨基酸总体同源性为97.5%～99.7%.通过PrM/C区段、E区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因Ⅰ型乙脑病毒.结论 新分离的乙脑病毒XJ69和XJP613株属于基因Ⅰ型,与上海三带喙库蚊分离株SH17M-07关系最为接近.     

3株肾综合征出血热病毒的分离和鉴定

目的了解浙江省肾综合征出血热（HFRS）流行特点及汉坦病毒（HV）型别，为防治提供科学依据。方法鼠肺HV抗原检测采用直接免疫荧光法（DFA），病毒分离采用阳性鼠肺研磨液接种幼龄长爪沙鼠，再经vero-E6细胞传代，用单克隆抗体DFA定毒株及分型。结果从捕自浙江省龙泉地区的8份阳性鼠肺中分离到3株HV，经DFA鉴定均为汉滩型（Ⅰ型）病毒，3株病毒在Vero-E6细胞中的感染滴度为10^4.75～10^5.25CCID50／ml。结论从鼠类肺组织中分离到3株汉滩型HV，毒株均能在Vero-E6细胞中较好增殖，有可能成为HFRS疫苗后备毒株。