婴幼儿致病性大肠埃希菌的毒力基因检测研究

目的通过对婴幼儿腹泻病例粪便标本进行致病性大肠埃希菌的分离鉴定及毒力基因检测,从分子生物学方面研究致病性大肠埃希菌引起婴幼儿腹泻的分布,以降低婴幼儿致病性大肠埃希菌的感染率。方法收集江西省儿童医院2011-2012年婴幼儿腹泻病例357份粪便标本,按照致病性大肠埃希菌分离鉴定程序用EC肉汤增菌过夜,增菌后用麦康凯琼脂培养基分离培养,可疑菌用API 20E生化鉴定出大肠埃希菌,然后用聚合酶链反应(PCR)检测致病性大肠埃希菌相应的毒力基因。结果 357份腹泻患者粪便标本中,检出37份携带毒力基因的致病性大肠埃希菌,检出率为10.36%,携带毒力基因的肠聚集性大肠埃希菌(EAggEC)、肠道致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠道侵入性大肠埃希菌(EIEC)、肠道出血性大肠埃希菌(EHEC)检出率分别为8.4%、0.56%、1.12%、0.28%,产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)未检出。结论婴幼儿腹泻病例中致病性大肠埃希菌主要由EaggEC引起,其次为EIEC,进一步证实对致泻大肠埃希菌进行PCR毒力基因检测具有重要临床意义。     

天津市重点场所室内空气PM2.5及尼古丁调查

目的了解天津市重点室内场所二手烟暴露情况,为促进《天津市控制吸烟条例》实施提供数据支持。方法于2012年12月—2013年2月在天津市7个区5类(医疗卫生机构、政府办公机构、公共交通等候场所、餐饮场所以及酒吧)44个场所进行了室内空气PM2.5监测,并在其中的10个场所进行了空气尼古丁浓度监测。结果餐饮场所的PM2.5浓度中位数在所监测的不同类型场所中最高,为156.0μg/m3,其次为酒吧;而其他场所的男卫生间二手烟暴露较严重,医疗卫生机构为129.5μg/m3,政府办公机构为102.0μg/m3,公共交通等候场所为116.0μg/m3;PM2.5浓度与场所内正在燃烧的香烟数量之间呈正相关(rs=0.281,P0.05);空气尼古丁浓度与PM2.5浓度呈正相关(rs=0.553,P0.05)。结论本次调查的天津市重点场所室内二手烟暴露仍处于较高水平,需要采取更加有针对性的措施减少二手烟暴露,保护公众免受其危害。     

HIV-1B/C重组型外膜蛋白env基因序列分析及表型预测

目的 克隆并分析HIV-1B/C重组型外膜蛋白env基因序列,根据其氨基酸序列进行表型预测,为疫苗的抗原设计奠定基础.方法 采集北京地区HIV-1 B/C重组型的抗凝全血标本,分离血浆和提取基因组DNA,采用巢式PCR方法扩增rev-env基因,对扩增产物进行序列测定.根据核苷酸序列推导出相应的氨基酸序列,并对重要的Env功能结构域进行深入的分析和比较.结果 从12例B/C重组型HIV-1感染者中成功克隆到7个rev-env基因,序列分析发现其中6个有完整的开放读码框（ORF）,全部为CRF_07B/C重组型.6个Env蛋白氨基酸N糖基化位点和数目没有显著变化;CD4受体结合位点高度保守;根据V3环氨基酸序列及静电荷数目预测全部使用CCR5辅助受体;GP120/GP41剪切位点高度保守,预测所有GP160前体都能有效剪切;对几个已知中和抗体的中和位点分析推测全部的6个序列都对2G12、2F5中和不敏感;对4E10、PG9及PG16中和敏感.结论 有必要进一步阐明env基因型与相关功能的关系,这将为疫苗和药物研究提供依据.     

朊病毒病实验室生物安全风险控制特点分析

朊病毒病（prion disaese）或可传播性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies,TSEs）是一类侵袭人类及多种动物中枢神经系统的退行性脑病,潜伏期长,100％病死率.人类的朊病毒病有克-雅病（Creutzfeldt-Jacob disease,CJD）,包括散发型、家族遗传型、医源型、变异型CJD（variant CJD,vCJD）,另外还有库鲁病（Kuru）、GSS综合征（Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome）、致死性家族型失眠症（fatal familial insomnia,FFI）,其致病因子是朊病毒.朊病毒为微小的蛋白感染颗粒,不包含核酸,与常规病毒不同[1].目前认为朊病毒是由在正常哺乳动物脑组织中存在的PrP蛋白（PrPC）经过构象转变而形成,又称PrPSc.在朊病毒患者中枢神经组织中可以检出异常致病蛋白PrPSc的沉积[1],但不同的朊病毒病具有不同的特点,主要表现在临床特征、潜伏期、脑组织中prpsc的分布、脑组织损伤的特点、能否诱导淀粉样变化,以及朊病毒的分子特征等,具有明显的＆quot;毒株＆quot;差异.鉴于朊病毒不同于传统病毒,具有独特的实验室检测技术[2],因此存在独特的生物风险形式.本文从朊病毒病原学特点和常见实验检测技术方面分析朊病毒实验活动中的生物风险形式,并提出相应的预防措施.     

HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因改造及其重组DNA疫苗的构建

目的 构建表达含有密码子优化的HIV-1 CRF01_AE亚型env基因的DNA疫苗,为多载体艾滋病治疗性疫苗的应用提供候选疫苗.方法 对HIV-1感染者血液样本进行型别分析,分型得到的AE亚型标本采用亚型特异性引物克隆env基因,通过序列比对获得其共有序列,对该序列按照哺乳动物密码子使用的偏嗜性进行优化,将人工合成的优化基因克隆至pVR载体,构建DNA疫苗.通过Western Blot方法比较优化前后env基因的表达.结果 成功获得32条具有完整的开放性阅读框的env克隆,型别分析确认均为CRF01_AE亚型.成功对其共有序列进行了优化、合成并构建了DNA疫苗pVR-mod.AE env,该疫苗与野生型的env基因（wt.AE env）相比可以高水平表达env基因,且不依赖Rev的存在.结论 对HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因的优化改造及重组DNA疫苗的构建是成功的.     

麦氏弧菌多位点序列分型方法的建立与应用

目的建立针对麦氏弧菌的多位点序列分型（MLST）方法,评价该方法的分型效果,并对收集的麦氏弧菌进行MLST分析。方法筛选出7个管家基因（ftsZ、gapA、mreB、gyrB、purM、recA、ropA）,设计特异引物,在17株麦氏弧菌中PCR扩增管家基因序列。 用DnaSP 6.12.03软件和Split tree 4.0软件评价基因多态性、中性进化和基因重组情况;根据7个管家基因的序列差异获得对应的序列分型（ST）型别,用BioNumerics 7.1软件对不同ST型别构建最小生成树和聚类图,并用eBURST 3.0软件计算克隆复合体（CCs）。结果所选的管家基因具有足够多的等位基因位点、序列差异和足够高的分辨率;7个管家基因的Split tree对所有麦氏弧菌的聚类一致;中性试验结果显示,7个管家基因在进化过程中受遗传漂变的影响较小。 MLST将17株麦氏弧菌分成14个ST型别,大多数菌株（64.70%）均单独形成一个ST型别,其中ST007形成了可能的优势克隆群。 这些菌株之间存在相对较远的遗传距离,在垂直传播上呈现出潜在的地域聚集性。结论本研究建立的麦氏弧菌的MLST方法能分析麦氏弧菌的种群结构和遗传进化关系。     

基于CRISPR/Cas蛋白的副溶血弧菌检测方法的研究

目的利用规律间隔性成簇短回文重复序列（CRISPR）免疫原理及Cas12a酶的特点构建一种快速检测副溶血弧菌（VP）的方法,实现对病原菌准确快速的检测和识别。方法本研究通过制备纯化Cas12a蛋白,筛选构建VP的gRNA,建立CRISPR-VP荧光检测系统,根据最终荧光扩增曲线判定CRISPR-VP检测方法的有效性。结果在CRISPR-VP检测方法中只在VP的序列存在时才会产生明显的荧光信号。结论本实验初步建立了基于CRISPR/Cas蛋白的VP的检测方法,为后续简易检测试剂的研制提供理论依据。     

金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SED序列多态性及进化分析

目的对不同来源金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC和SED的序列多态性及进化进行分析,为进一步了解不同亚型的毒素表达差异及食品风险评估提供理论依据。方法选择我国部分地区不同来源经典肠毒素SEA、SEB、SEC和SED阳性的菌株共90株,采用PCR方法扩增其序列并测序。 并与GenBank下载的经典肠毒素亚型代表序列进行比对分析,用MEGA 7软件构建系统发生树。结果SEA氨基酸序列存在3个突变位点,主要位于N端和C端;有3个亚型,SEA阳性菌株以SEA1亚型为主。 SEB氨基酸序列在两端的突变较中间活跃,存在18个突变位点;有11个亚型,SEB阳性菌株主要为SEB1和SEB2亚型。 SEC氨基酸序列突变位点有24个,分布在整个序列;共8个亚型,SEC阳性菌株以SEC3亚型为主。 SED氨基酸序列相对保守,共7个亚型,SED阳性菌株以SED1为主。 本研究还发现2个新亚型,分别命名为SEB9和SEC5,均来自患者分离菌株。结论SEA和SED的氨基酸序列较为保守,SEB和SEC的氨基酸突变位点较多。4种肠毒素的氨基酸序列进化树均分为2个分支。 本研究选取的菌株以SEA1、SEB1、SEB2、SEC3和SED1亚型为主。     

新型冠状病毒英国变异株的核酸检测试剂有效性和敏感性评估

目的:评估三种商用试剂盒对新型冠状病毒英国B.1.1.7变异株的检测效果。方法:收集2021年1月北京市某区新冠肺炎聚集性疫情期间的10份鉴定为B.1.1.7变异株的咽拭子、鼻咽拭子样本,同时收集2020年6—12月北京市监测发现的10份鉴定为非变异株的咽拭子、鼻咽拭子样本做为对照。用三种可检测该变异株的商业化试剂盒分...     

蝙蝠寄生蛛蝇中分离3株肯科伊病毒的全基因序列特征分析

目的了解云南省蝙蝠体表寄生蛛蝇中肯科伊病毒(Kaeng Khoi virus, KKV)的感染情况。方法 2014年在保山市和2017年在瑞丽市采集蝙蝠体表寄生蛛蝇标本并进行鉴定, 应用细胞组织培养法进行病毒分离, 对阳性分离物进行序列扩增测序, 对病毒全基因序列进行同源性和系统进化分析。结果用蛛蝇标本研磨上清液接种BHK-21细胞, 从瑞丽市和保山市蛛蝇标本分离到3株阳性分离物(WDBC1704、WDBC1710和BSBC1406), 均能使BHK-21细胞出现圆缩、脱落的细胞病变。经RT-PCR和高通量测序扩增后, 获得3株阳性分离物的全基因组序列。系统进化分析显示3株阳性分离物的S、M、L基因均与泰国分离的KKV原型株PSC-19在同一进化支。本次分离的3株KKV与云南省既往分离株WDBC1403亲缘关系最近, 其中BSBC1406株又形成一个独立的小分支。序列对比显示3株分离株之间在M基因上存在较大差异, BSBC1406与其他2株相似度仅为78.0%～78.1%, 开放阅读框区中Gc蛋白的氨基酸相似度均为85.3%。结论从云南蝙蝠寄生蛛蝇中新分离的3株KKV与原型株有较大差异...