DNA-PKcs单链抗体DPK3-scFv的原核表达纯化及生物学作用研究

目的原核表达和纯化DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs）单链抗体DPK3-scFv,观察其透入细胞及干扰辐射诱发DNA-PKcs磷酸化修饰的生物学作用。方法 PCR扩增DPK3-scFv基因,插入到带有His标签的原核表达载体pET28a,重组质粒转化工程菌BL21、优化表达。免疫荧光显微镜和蛋白免疫印迹观察DPK3-scFv透膜进入HeLa细胞及对电离辐射诱发靶分子DNA-PKcs的磷酸化修饰的影响。结果成功构建单链抗体表达载体pET28a-DPK3-scFv,在2xYT培养基（16 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g NaCl溶于1 L双蒸水中,高压灭菌）、20℃温度、0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropy1-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）条件下诱导可溶性表达,进一步获得了纯化单链抗体。DPK3-scFv能体外抑制DNA-PKcs激酶活性,纯化的DPK3-scFv可跨膜进入细胞内,并与DNA-PKcs共定位在细胞核。DPK3-scFv对γ射线照射HeLa细胞中DNA-PKcs及其S2056位点（pS2056）的自磷酸化具有显著抑制作用。结论通过优化条件获得了可溶性原核表达的DPK3-scFv单链抗体,具有抑制其靶分子DNA-PKcs的磷酸激酶活性。     

香兰素衍生物BVAN08对人脑胶质瘤细胞的放射增敏作用及机制研究

Objective To provide more convincing evidences and experimental data for exploring vanillin derivative BVAN08,6-bromine-5-hydroxy-4-methoxy-benzaldehyde,as a new anticancer drug,and to investigate the effect on the growth,radiosensitization of human glioma cell line U-251 and the relative mechanism.Methods The effect of BVAN08 on cell proliferation of U-251 and radiosensitivity to 60Co γ-rays (irradiation dose rate 2.3 Gy/min) were analyzed with MTT and colony-forming ability assay.Change in cellular morphology was observed by using light microscope.Change in cell cycle and apoptosis was detected with flow cytometry.The autophagy was observed by using TEM (irradiation dose rate is transmission electron microscope).DNA-PKcs protein level was detected through Western blot analysis.Results BVAN08 exhibited a dose- and time-dependent inhibition on the proliferation of U-251 cells during the concentration range of 10-100 mol/L (t = 1.83-3.07,P ＜ 0.05).IC50 at 48 h and 72 h after administration with BVAN08 were 55.3 and 52.7 mol/L,respectively.Obvious G2/M arrest was induced in U-251 cells after 4 h administration with BVAN08,and reached peak at 12 h.The G2/M population reached 63.3% in U-251 cells after 12 h administration of 60 μmol/L BVAN08 and kept increasing with the time,while both apoptosis and autophagic cell death were induced.The most effective radiosensitization time for BVAN08 treatment was 12 h before irradiation.The enhancement ratio of radiosensitivity was 3.14 for 20 μmol/L of BVAN08 12 h before 2 Gy irradiation.Conclusions BVAN08 can nduce apoptosis as well as autophygic cell death of U-251 cells,and sensitize U-251 cells.The mechanism of its radiosensitizing effect might be associated with the induction of G2/M arrest and inhibition of DNA-PKcs expression.BVAN08 seemed to be a romising radiosensitizing anticancer drug.     

Tat蛋白与Plk1相互作用位点的鉴定

目的确定Tat蛋白与Plk1的相互作用及作用位点。方法构建tat和plk1基因的不同表达载体,通过GST-pull down、免疫共沉淀检测它们表达产物的相互作用位点,激光共聚焦确定其在细胞内的定位。结果 GST-pull down和免疫共沉淀实验发现Tat蛋白能结合在Plk1 N端的激酶区域,激光共聚焦发现Tat蛋白和Plk1在细胞核内有相同的亚细胞定位。结论 Tat蛋白能结合在Plk1 N端的激酶区域引起Plk1 T210的磷酸化水平提高,从而激活Plk1的活性,导致细胞周期的紊乱。     

烟草特异性亚硝胺NNK对支气管上皮细胞端粒酶活化作用的探讨

目的:了解4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶)-1-丁酮[4-(methyl-nitrosamino)-1-(3-py-ridyl)-1-butanone,NNK]时支气管上皮细胞(BEP2D)端粒酶活性的影响.方法:NNK处理BEP2D细胞后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞存活率,用端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附法(TRAp-EL-ISA)检测端粒酶活性,蛋白质印迹法检测端粒酶催化亚单位人端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白的表达.结果:10 mg/LNNK孵育24、48及72 h后,BEP2D细胞存活率不受影响,但其端粒酶活性均增高,而hTERT蛋白表达增高则在孵育48及72 h时间点.结论:NNK可刺激BEP2D细胞端粒酶活化及hTERT蛋白的表达.     

核辐射对人体的生物学危害及医学防护基本原则

核辐射是指在原子的核反应过程中如裂变、衰变释放出的不同能量粒子和电磁辐射,其作用于物质可引起电离和激发,由此产生生物学效应,因此属于电离辐射。最主要的核辐射有α粒子、β粒子、γ射线和中子等。本文就核辐射的主要物理和生物物理特征、对人体的主要危害以及防护原则逐一讨论。核辐射对生物体危害的严重程度或危险概率,与辐射的品质、辐射剂量率和生物体吸收剂量密切相关。     

EGFR反义重组腺病毒治疗乳腺癌的实验研究

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)反义重组腺病毒AdE5对乳腺癌细胞移植瘤的作用。方法:人乳腺癌细胞MDA-MB-231接种于裸鼠右侧背部皮下形成肿瘤后,以AdE5、空病毒载体AdCO1瘤内注射,每只109pfu/100μl。共注射2次。定期测量肿瘤体积,计算相对生长率。肿瘤组织HE染色后做组织学观察,以免疫组化分析K i-67表达。结果:AdE5瘤内注射可抑制肿瘤生长(相对生长率<1)。组织学研究显示肿瘤内坏死明显,免疫组化分析发现AdE5治疗后肿瘤K i-67指数显著低于AdCO1及PBS组。结论:以腺病毒载体介导的EGFR反义RNA转导可有效地抑制乳腺癌细胞的在体肿瘤生长。     

早期反应基因Ier5启动子区辐射敏感的转录因子结合位点研究

目的 探讨辐射诱导早期反应基因5(Ier5)的转录调控机制。方法 运用缺失体构建、定点突变、电泳迁移率实验(EMSA)及染色质免疫共沉淀(ChIP)技术,确定宫颈癌HeLa细胞中Ier5基因启动子区域、转录因子及其结合位点。结果 发现Ier5基因的启动子区可能在缺失体Ier5-8所包含的范围(-408~-238 bp)内。Ier5基因具有2个转录因子,分别为GCF、NFI,其中GCF的结合位点在Ier5基因启动子-388~-382 bp和-274~-270 bp处,NFI的结合位点在Ier5基因启动子-362~-357 bp处。GCF抑制Ier5基因的表达,抑制作用随γ射线吸收剂量的增加而减弱,NFI促进Ier5基因的表达。结论 Ier5基因启动子最可能的区域为-408~-238 bp,该区域存在2个辐射敏感的转录因子GCF和NFI的结合位点。GCF对Ier5基因的顺式作用元件起负调节作用,而NFI起正调节作用。     

siRNA抑制DNA-PKcs表达及对HeLa细胞增殖的影响

背景与目的：建立抑制DNA-PKcs表达的细胞模型,以此探讨DNA-PKcs的功能。材料与方法：构建DNA-PKcs的siRNA抑制表达载体,利用Lipofectamine介导,转染HeLa细胞,筛选稳定表达的转化克隆。Western blot检测DNA-PKcs表达。通过细胞生长速度检测细胞辐射敏感性变化。结果：设计了作用于DNA-PKcs不同位点的3条siRNA,并构建表达质粒,转染HeLa细胞,获得了3个稳定转化克隆,Western blot分析表明其DNA-PKcs表达受到明显抑制,细胞对了射线和紫外线的敏感性增加,接种裸鼠后的肿瘤生长速度减慢。结论：成功建立了DNA-PKcs表达抑制细胞模型,并且发现DNA-PKcs表达抑制后除影响细胞的辐射敏感性外,还可能与肿瘤细胞增殖有关。     

在线固相萃取-液质联用法定量分析生物基质中丁香醛及其在大鼠体内药代动力学研究中的应用

目的建立测定SD大鼠血浆中丁香醛的在线固相萃取-液质联用法(on-line SPE LC-MS/MS)。方法采用乙腈沉淀蛋白后,取上清经on-line SPE系统进行血浆样品预处理,选用香兰素为内标,以LC-MS/MS法测定大鼠血浆中丁香醛的含量。色谱柱为GRACE Alltima HP C18(50 mm×2.1 mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸(60∶40,V∶V),流速为0.4 ml·min-1。电喷雾离子化(ESI)方式,采用多反应监测,检测离子为正离子,分别选择m/z 182.3→m/z123.1和m/z 153.1→m/z 93.0作为丁香醛和内标物香兰素的检测离子对。结果丁香醛在10.0～2 000μg·L-1范围内线性关系良好(r=0.9997)。方法的准确度(相对误差,RE)范围为-8.5%～5.9%;日内精密度(相对标准偏差,RSD)<16.3%,日间精密度RSD<13.8%。SD大鼠灌胃给予丁香醛(17.5 mg.kg-1和70 mg.kg-1)后,主要药动学参数:T12分别为41.9 min和54.0 min、Cmax分别为361.0μg·L-1和944.0μg·L-1、Tmax分别为10.0 min和27.5 min、CL分别为848.1 ml·min-1.kg-1和683.9 ml·min-1·kg-1。结论建立的基质中丁香醛的测定方法快速、准确、特异性好,适用于丁香醛在SD大鼠体内的药代动力学研究。     

60Coγ射线诱导正常人淋巴母细胞XPCmRNA表达的剂量相关性研究

目的：研究正常人淋巴母细胞AHH-1电离辐射作用后XPC mRNA表达的剂量效应关系,探索建立一种基于基因表达变化的新型辐射生物剂量分子标志物的可能性。方法：剂量为1、2、4、6、8和10Gy的60Coγ线照射AHH-1细胞后4、10、24 h收集细胞,应用实时荧光定量PCR技术对XPC mRNA表达水平进行相对定量检测。结果：在0～10 Gy的γ射线照射后4 h,AHH-1细胞中XPC mRNA表达水平就显著增加,并达到第1个高峰,维持至10 h左右或有所降低,随后继续上升,持续时间可达24 h。在0～8 Gy剂量范围内辐射诱导XPC mRNA表达丰度随照射剂量的升高而上调,具有显著的剂量依赖性。结论：正常人淋巴母细胞XPC mRNA表达水平与电离辐射之间具有良好的剂量效应和时间效应关系,有成为新的辐射生物剂量计的潜力。