HIV-1 Tat蛋白对DNA修复基因及细胞周期相关基因表达的影响

目的:探讨HIV-1 Tat蛋白对DNA修复基因及细胞周期相关基因表达影响.方法:使用包含102个与DNA损伤修复和细胞周期相关的基因微阵列检测人横纹肌肉瘤细胞(TE671)及已转染tat基因的TE671细胞(TT2)基因表达谱的改变;使用半定量RT-PCR分析DNA-PKcs在mRNA水平表达;Western印迹法检测DNA-PKcs表达变化;荧光染色法检测电离辐射后细胞凋亡.结果:在基因芯片的检测中,发现与DNA损伤修复及细胞周期调控相关的6个基因CdC25C、KIF2C、CdC20、DNA-PKcs、CTS1、WEE1在转染tat基因的细胞中表达下调;DNA-PKcs的表达在表达Tat蛋白细胞中不论是在mRNA和蛋白水平均被抑制;接受电离辐射后,表达Tat蛋白的细胞凋亡增加.结论:HIV-1 Tat蛋白使细胞对电离辐射敏感,部分通过抑制DNA-PKcs表达来降低DNA双链断裂的修复能力,本研究为了解AIDS合并肿瘤患者对放射治疗敏感性提供了重要实验数据.     

6-溴异香兰素对HeLa细胞的增殖抑制及放射增敏作用

目的研究香兰素衍生物中的6-溴异香兰素（6-溴-5-羟基-4-甲氧基苯甲醛,BVAN08）对HeLa细胞增殖和放射敏感性的影响,为开发新的抗癌和放射增敏药物提供理论依据。方法利用MTT法检测细胞增殖,单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤,流式细胞术检测细胞周期,克隆形成率法检测细胞放射敏感性,AnnexinⅤ/PI染色法检测细胞凋亡。结果研究表明BVAN08在10～20μmol/L以上浓度就显示出对HeLa细胞增殖的抑制作用,抑制程度具有剂量依赖性,抑制细胞存活的IC50值为19.07μmol/L。BVAN08能诱发细胞DNA双链断裂损伤,作用4h就开始诱发细胞周期G2/M阻滞,随时间延长阻滞更加明显。BVAN08明显降低DNA修复蛋白DNA-PKcs的表达水平,20μmol/LBVAN08与2Gyγ射线复合作用可以显著增加细胞对射线的敏感性,增加细胞凋亡率。结论 BVAN08抑制HeLa细胞增殖,提高细胞的放射敏感性,其放射增敏作用与降低DNA-PKcs蛋白表达水平和G2/M阻滞有关。     

DNA-PKcs反义核酸增强HeLa细胞对辐射及化疗药物顺铂的敏感性

目的构建表达DNA-PKcs反义核酸的真核表达载体，建立DNA—PKcs表达被反义核酸抑制的细胞模型。方法采用RT-PCR扩增DNA—PKcs的cDNA片段，DNA重组技术构建四环素控制表达的真核表达载体；利用Lipofectamine介导基因转染，Western blot分析鉴定反义核酸抑制DNA—PKcs表达的细胞模型；细胞克隆形成法和细胞生长曲线分析细胞对UV和顺铂的敏感性。结果克隆了DNA-PKcs 5’端320bp cDNA片段，重组于tet启动子控制表达质粒pCl^neo-Tet-splice，转染Hela细胞，获得3个稳定转化克隆；Western blot结果表明细胞中DNA-PKcs表达受到反义核酸的抑制，并且细胞对紫外线辐射和顺铂敏感性增加。结论成功建立了DNA-PKcs表达受到反义核酸抑制的细胞模型，抑制DNA-PKcs表达提高了细胞的辐射和顺铂的敏感性。     

西妥昔单抗联合化疗药物的方案优化及其机制研究

目的：探讨表皮生长因子受体（EGFR）的单克隆抗体西妥昔单抗（Cetuximab,C225）与化疗药物联合作用于大肠癌和肺癌细胞的最佳联合方案及其联合机制。方法：采用MTT法测定不同药物单药、两药及三药联合分别对大肠癌细胞LoVo和肺腺癌细胞A549的IC50值;计算不同联合方案的联合指数（combination index,CI）,以确定最佳联合方案;Western blot法检测不同给药方案对EGFR下游信号通路的关键分子AKT、MAPK磷酸化表达的影响;流式细胞仪检测不同联合方案对细胞周期分布及凋亡比例的影响。结果：C225与化疗药物联合可增强其对细胞的杀伤作用,且以先化疗药物、后C225的序贯方案协同作用最强。先化疗药物、后C225的序贯方案对AKT、MAPK磷酸化的抑制明显强于其它联合方案,并且能诱导更多肿瘤细胞发生凋亡以及产生G2/M期阻滞。结论：C225与化疗药物联合存在最佳联合方案,其机制可能与药物对EGFR下游信号通路关键分子的磷酸化抑制及促进细胞凋亡和影响细胞周期分布有关。     

同源重组修复基因RAD51可提高PTEN缺失细胞基因组稳定性

目的：研究同源重组修复基因RAD51对PTEN缺失小鼠胚胎成纤维细胞基因组稳定性的影响。方法：应用免疫荧光和中性单细胞电泳技术观察PTEN缺失后自发性和辐射诱导DNA双链断裂情况;并构建PTEN缺失细胞稳定转染RAD51的细胞系,γ射线照射后检测细胞存活率。结果：PTEN缺失导致细胞自发性和辐射诱导DNA双链断裂增多;转染RAD51后细胞存活率增高,辐射诱导的DNA双链断裂减少。结论：同源重组修复基因RAD51可以提高PTEN缺失细胞基因组稳定性。     

LKB1蛋白在肺腺癌组织中的表达及临床意义

目的：了解LKB1蛋白在肺腺癌组织中表达的临床意义.方法：应用免疫组化法检测62例肺腺癌组织中LKB1蛋白表达情况.结果：LKB1蛋白在肺腺癌细胞及正常肺支气管上皮均有表达,弥漫性分布于细胞质,细胞核亦有表达.肺腺癌组织中LKB1蛋白表达的阴性率为38.7%（24/62）.LKB1的表达与肺腺癌TNM分期中的淋巴结转移（N）及临床分期有显著的相关性,X^2=10.620,P=0.014;X^2=18.635,P=0.000.LKB1蛋白阴性组预后较差,中位生存期为15个月,而LKB1阳性组的中位生存时间为29个月,两者比较差异有统计学意义,X^2=1 5.350,P=0.000.结论：LKB1蛋白表达下降与肺腺癌发生淋巴结转移相关,是肺腺癌预后不良的风险因素之一.     

表皮生长因子受体反义重组腺病毒联合放射线对乳腺癌细胞的作用

目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)反义重组腺病毒联合放射线对乳腺癌细胞的作用。方法人EGFR的cDNA片段被反向亚克隆入E1／E3缺失的5型腺病毒载体中而得到AdE5，EGFR反义RNA的表达由CMV启动子控制。进而研究其联合γ射线对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231成克隆能力及细胞周期分布的影响。结果MDA-MB-231细胞被AdE5感染后，EGFR蛋白质的表达被强烈地抑制。AdE5感染后以γ射线照射细胞，成克隆能力被抑制。且这种作用与病毒量和照射剂量相关联。进而流式细胞仪分析显示，300pfu／细胞的AdE5感染可使MDA-MB-231细胞摆脱对放射线抗拒的G0 G1期，进入对放射线敏感的G2 M期，从而使AdE5联合放射线表现为协同效应。结论以腺病毒载体介导的EGFR反义RNA转导可有效地用于针对EGFR的反义治疗策略，提高放射线对乳腺癌细胞杀灭作用。     

HIV-1 Tat对细胞周期蛋白的影响

目的研究HIV-1 Tat对细胞周期蛋白(cyclinB1)的影响。方法利用人横纹肌肉瘤细胞(TE671)及已转染tat基因的TE671细胞(TT2)细胞系;通过Western印迹检测辐射前后CyclinB1表达变化;使用Northern-Blot及半定量RT-PCR,分析cyclinB1在mRNA水平表达;放线菌酮阻断蛋白合成实验及免疫共沉淀实验检测cyclinB1的稳定性。结果细胞在接受电离辐射和未接受照射情况下,cyclin B1的表达在转染tat基因细胞中明显增强,Tat蛋白不影响cyclinB1在mRNA水平的表达;放线菌酮阻断蛋白合成实验及Tat蛋白诱导细胞电离辐射后泛素化实验均表明,cyclinB1表达水平的增强主要发生在蛋白质合成后的修饰。结论 HIV-1 Tat蛋白能提高Cyclin B1的稳定性,降低CyclinB1泛素化水平;该项研究也许有助于利用分子生物学手段,干预Tat蛋白的表达以调控CyclinB1及相关蛋白的表达,进而改变肿瘤细胞周期的进程,影响临床的疗效。     

甲状腺激素对大鼠急性肝衰竭肠粘膜屏障功能的保护作用

目的探讨补充外源性甲状腺激素(thyroid hormone,TH)对急性肝衰竭(acute hepatic failure,AHF)肠粘膜屏障的保护作用.方法 SD大鼠36只,随机分为3组:对照组(SO组)、急性肝衰竭组(AHF组)和治疗组(AHF+TH组).腹腔注射硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)制作AHF模型.15μg/kg的标准腹腔注射三碘甲状腺原氨酸(T3),取下腔静脉血检测TH水平,取小肠组织测二胺氧化酶(DAO)活性,取末段回肠行普通HE染色观察,并使用图像分析系统测量小肠绒毛长度.结果 AHF+TH组较AHF组小肠组织DAO活性升高(P<0.05),小肠绒毛长度升高(P<0.05),肠粘膜损伤程度降低(P<0.05).结论补充外源性TH对AHF时肠粘膜屏障有明显的保护作用.     

香兰素衍生物VND3207对小鼠骨髓细胞遗传损伤的防护效应研究

目的 研究香兰素衍生物4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛(VND3207)对γ射线整体照射小鼠骨髓细胞遗传损伤的防护作用。方法 BALB/c小鼠按10、50和100 mg/kg不同剂量灌胃给药,1次/d,连续5 d,最后一次给药后2 h, 2 Gy ⁶⁰Co γ射线照射,照射后48 h观察小鼠骨髓嗜多染红细胞微核、染色体畸变和骨髓有丝分裂指数的改变。结果 不同剂量(10、50和100mg/kg)的VND3207均能有效地降低小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率(t=2.40～4.26,P<0.05)和染色体畸变率(t=2.36～3.52,P<0.05),同时提高骨髓有丝分裂指数。药物保护效果与给药剂量呈依赖关系,其中100 mg/kg剂量组的微核率和染色体畸变率与单纯照射组相比,分别降低了65%和50%。结论 VND3207对⁶⁰Co γ射线诱发的小鼠骨髓辐射损伤有良好的保护作用。