纳米晶胶原基骨与人骨髓间充质干细胞的复合培养

目的：观察人骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨的复合培养，证实纳米晶胶原基骨是否可以成为组织工程的良好载体材料。 方法：实验于2003—07／2004—08在清华大学材料科学与工程系完成纳米晶胶原基骨的制备及处理，在中日友好临床医学研究所免疫室完成纳米晶胶原基骨与骨髓间充质干细胞复合培养。健康自愿献髓者3人，在中日友好医院骨坏死与骨循环实验室体检。应用仿生原理制备纳米晶胶原基骨，体外培养骨髓间充质干细胞并与材料复合，通过共聚焦显微镜和环境扫描电镜观察骨髓间充质干细胞与材料的复合情况。 结果：①共聚焦显微镜显示：在各层面扫描骨髓间充质干细胞均深入纳米晶胶原基骨的内部孔隙。②环境扫描电镜显示：第2天细胞贴附在多孔材料上，在纳米晶胶原基骨底部靠近培养板处细胞黏附明显较纳米晶胶原基骨上其他部位多，细胞也开始伸展，伸出伪足向材料微孔中长入，孔隙内见不到桥接的细胞连接细胞在整个材料及孔隙内表面贴附、伸展。第7天时细胞在材料上完全铺展。伪足向材料微孔中长入，在部分直径较小的孔隙中（70～150μm），细胞之间突起相互连接呈桥状。纳米晶胶原基骨临近培养板的一面有较多细胞生长，主要在材料的表面和材料的裂隙中，孔隙中较少。第14天，大量细胞在纳米晶胶原基骨表面和孔隙中生长，尤以孔隙中明显。细胞之间广泛存在突起连接，在孔隙中呈网状互相相连。 结论：纳米晶胶原基骨是良好的组织工程支架材料，易与骨髓间充质干细胞复合．适合种子细胞的贴附、生长、增殖和分化。     

APP17肽和救脑益智胶囊水提液对D-半乳糖脑老化小鼠海马蛋白磷酸酯酶1表达的影响

背景：D-半乳糖衰老模型具有与人类自然衰老相类似的生化改变，蛋白磷酸酯酶1在D-半乳糖脑老化小鼠表达降低是否与脑老化过程有关还有待于进一步研究。 目的：探讨APPl7肽及救脑益智胶囊水提液对D-半乳糖脑老化小鼠海马蛋白磷酸酯酶1表达的影响。 设计：随机对照观察。 单位：首都医科大学基础医学院病理学教研室和宣武医院脑老化研究室。 材料：实验于2003—07／2004—07在首都医科大学文验动物中心完成，选用雄性昆明小鼠40只。购自中国医学科学院药物研究所。 方法：将昆明小鼠随机分为5组：正常对照组、D-半乳糖对照组、APP17肽治疗组、中药小剂量治疗组、中药大剂量治疗组，每组动物8只。脑老化小鼠模型D-半乳糖组，APP17肽治疗组，中药小剂量治疗组，中药大剂量治疗组4组每日皮下注射半乳精50mg／kg体质量，同时在APP17肽治疗组皮下注射APPl7肽，每次每只小鼠注射含APP17肽0．35μg的生理盐水0．1mL，1次／d，连续注射3个月。中药冶疗组分别给予0．3g/kg和1．0g/kg的救脑益智水提液（由北京朝阳门医院和山西曲沃传统医学研究所研制，其主要成分有：党参、白术、龟甲、穿山甲等）灌胃，1次／d。两个对照组每天注射和灌注等量的生理盐水，3个月后取脑组织做蛋白磷酸酯酶1免疫组织化学染色。 主要观察指标：免疫组织化学染色检测各组动物海马蛋白磷酸酯酶1的表达。 结果：40只小鼠均进入结果分析，无脱失值。D-半乳糖小鼠和大剂量救脑益智胶囊水提液治疗组小鼠海马蛋白磷酸酯酶1阳性细胞数目少，染色淡；正常小鼠、APP17肽保护和救脑益智胶囊水提液小剂量治疗的D-半乳糖小鼠海马阳性反应神经冗数目多，胞浆与突起深染。 结论：抑制凋亡的蛋白磷酸酯酶1在D-半乳糖小鼠海马表达降低。APP17肽和小剂量救脑益智胶囊水提液治疗能影响D-半乳糖脑病小鼠脑内蛋白磷酸酯酶1的表达，使之接近正常。而大剂量救脑益智胶囊水提液治疗无此作用．其量效关系特点还需要进一步考察验证。     

荔枝核提取液对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血生化指标的干预实验

目的：通过测定糖耐量变化，分析荔枝核提取液对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠生化指标的干预作用。方法：实验于2005—12／2006—01在右江民族医学院生化教研室完成。①荔枝核，为广西百色市靖西县产酸荔枝果核，晒干后粉碎，水提取，加热煮沸30min后，过滤去渣浓缩，加乙醇沉淀，再过滤去沉淀，加热挥发乙醇，提取，得到含浓度1．2g／mL生药水提液。②选取清洁级健康昆明种小白鼠40只，分为正常对照组、模型对照组、荔枝核提取液低浓度组、荔枝核提取液高浓度组，10只／组。⑧除正常对照组外，其余各组均按200mg／kg体质量腹腔注射四氧嘧啶水溶液建立糖尿病模型。48h后测血糖，血糖未升高的小鼠按100mg／kg腹腔注射四氧嘧啶水溶液，连续追加2次。③待空腹血糖升高和糖耐量异常后，荔枝核提取液低浓度组用荔枝核水提取液给予灌胃治疗，每只小鼠剂量为0．5mL（内含0．012g荔枝核生药）；荔枝核提取液高浓度组每只小鼠剂量为0．5mL（内含0．024g荔枝核生药）；正常对照组、模型对照组给予等量蒸馏水灌胃。1次／d，连续7d。④测定造模前后空腹血糖，治疗前后糖耐量血糖，治疗后血清丙氨酸氨基转移酶、尿素、三酰甘油、总胆固醇含量。制备大脑匀浆，测定乙酰胆碱酯酶活性、超氧阴离子自由基（O2^-）浓度和清除率、蛋白含量。结果：实验选取健康昆明种小白鼠40只，全部进入结果分析。①造模前后各组小鼠血糖含量的变化：与造模前比较，造模后2，6，9d模型对照组、荔枝核提取液低浓度组、荔枝核提取液高浓度组血糖含量均显著升高，而正常组无明显变化。②治疗前后各组糖耐量试验血糖含量的比较：治疗前30min，与正常对照组比较，其余3组血糖含量均明显升高（P〈0．05或P〈0．01），显示耐糖量较差。治疗后30min，与正常对照组比较，其余3组血糖含量亦均明显升高（P〈0．05或P〈0．01）。治疗后2h除模型对照组外，荔枝核提取液低浓度组、荔枝核提取液高浓度组均恢复到治疗前空腹水平。③治疗后各组小鼠血清生化指标的测定结果：荔枝核提取液高浓度组总胆固醇明显高于荔枝核提取液低浓度组、正常对照组；荔枝核提取液高浓度组、荔枝核提取液低浓度组、模型对照组尿素含量均明显高于正常对照组（P〈0．01）。④治疗后各组小鼠脑匀浆中生化指标的测定结果：模型对照组乙酰胆碱酯酶活性和O2^-浓度均明显高于其他各组（P〈0．01），O2^-清除率明显低于其他各组（P〈0．01），脑蛋白明显低于荔枝核提取液高浓度组（P〈0．05）。结论：荔枝核提取液能够明显改善四氧嘧啶糖尿病小鼠大脑胆碱能系统传递功能，加速超氧阴离子自由基的清除率，对血脂和肝、肾功能的保护作用尚不明显。     

姜黄素对大鼠肠黏膜肿瘤坏死因子α及白细胞介素4的调控作用

目的:探索中药姜黄素制剂对肠炎模型大鼠肠黏膜肿瘤坏死因子α及白细胞介素4的调控作用。方法:实验于2002-01/2005-01在南方医科大学动物实验中心及南方医院消化研究所完成。180只大鼠随机分为正常乙醇对照、模型、柳氮磺胺吡啶对照、姜黄素预防、姜黄素治疗、N-乙酰半胱氨酸对照组,每组30只。除正常乙醇对照组用体积分数为0.5的乙醇2mL灌肠外,其余各组均采用50g/L三硝基苯磺酸50mg溶于体积分数为0.5的乙醇2mL中灌肠,建立大鼠肠炎模型。柳氮磺胺吡啶对照组在造模前3d给予5g/L柳氮磺胺吡啶;姜黄素预防组在造模前3d给予20g/L姜黄素;姜黄素治疗组在造模后立即给予20g/L姜黄素;N-乙酰半胱氨酸对照组在造模前3d给予2g/LN-乙酰半胱氨酸。造模2周后处死存活大鼠,分析大鼠体质量。应用半定量反转录聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子α(致炎因子)及白细胞介素4(抑炎因子)mRNA的表达。结果:①实验大鼠造模过程中死亡30只,进入结果分析150只,正常乙醇对照组30只、模型组18只、柳氮磺胺吡啶对照组23只、姜黄素预防组28只、姜黄素治疗组24只、N-乙酰半胱氨酸对照组27只。②大鼠体质量分析:柳氮磺胺吡啶组、姜黄素预防组、姜黄素治疗组、N-乙酰半胱氨酸组显著高于模型组(P<0.05),N-乙酰半胱氨酸组显著高于柳氮磺胺吡啶组、姜黄素预防组、姜黄素治疗组(P<0.05),柳氮磺胺吡啶组、姜黄素预防组、姜黄素治疗组组间比较无显著差异(P>0.05)。③姜黄素可显著抑制肠黏膜肿瘤坏死因子αmRNA的高表达,各组均未见白细胞介素4mRNA的表达。结论:姜黄素与柳氮磺胺吡啶治疗对改善大鼠消瘦效果相同。姜黄素能使肠炎大鼠肠黏膜肿瘤坏死因子α水平下调,从而对其肠黏膜有免疫保护作用,经提纯的天然单体姜黄素可能具有肠黏膜炎性病变的组织修复作用。     

rhIL-3和GM-CSF对γ线照射猴外周血淋巴细胞损伤的防护作用研究

目的观察重组人白细胞介素-3(rhIL-3)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)单用与伍用对3.0 Gy γ线照射猴外周血淋巴细胞损伤的防护作用,为造血生长因子用于急性放射病的治疗提供依据.方法 30只恒河猴随机分为rhIL-3 (20和60 μg*kg-1*d-1)、GM-CSF(10 μg*kg-1*d-1)、IL-3+GM-CSF、照射对照及正常对照共6个组.γ线全身照射3.0 Gy连续给药21 d后,用碱磷酶免疫组织化学法检测T细胞亚群、Bax和Bcl-2蛋白,用原位末端标记方法检测淋巴细胞凋亡率.结果①照射后外周血淋巴细胞数、T细胞及其亚群均显著低于正常组,照射对照组T、TH和Ts淋巴细胞分别下降至正常对照组的42%、41%和57%.②单独给予GMCSF和GM-CSF+IL-3后,外周血淋巴细胞数量及T、TH细胞的降低均受到明显抑制,两组的淋巴细胞数均相当于照射对照组的1.48倍,GM-CSF组T、TH细胞分别为对照组的1.57和1.76倍,GM-CSF+IL-3组T、TH淋巴细胞分别为对照组的1.48和1.72倍.③照射后淋巴细胞出现大量凋亡;用GM-CSF和GM-CSF+IL-3后能明显抑制照射引起的淋巴细胞凋亡,两组淋巴细胞凋亡率分别降低到照射对照组的41%和48%.结论一定剂量的GM-CSF或GM-CSF+IL-3能明显抑制照射引起的淋巴细胞以及T和TH细胞的降低;上述造血因子抑制辐射引起的淋巴细胞下降和改善免疫功能的机制之一是通过抑制淋巴细胞凋亡途径实现.     

重症急性胰腺炎治疗的现况和展望

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一种常见急腹症,其发病率在急腹症中占第3-5位。许多报告指出,该病有逐年增加的趋势,这与胆道疾病发病率的增加有关,其发病女性多于男性。临床上AP表现差异极大,经一般性治疗即可康复的为轻型AP,有人称之为"自限性疾病";发病凶险、病死率极高的为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP),目前统计其病死率可高达20％-30％。长期以来,对于SAP的治疗一直存在分歧,出现过多次内科与外科治疗、手术与非手术、急症手术与择期手术、规则性胰腺切除与腐胰清除     

大鼠白色脂肪组织来源血管内皮生长因子受体阳性细胞向内皮细胞的诱导分化

目的:观察大鼠白色脂肪组织作为内皮祖细胞来源的可能性。方法:实验于2004-12/2005-04在上海组织工程重点实验室完成。取3周龄Wistar大鼠腹股沟白色脂肪组织,消化法得到的细胞接种在培养皿内,用含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养基培养,传至第2代,应用免疫磁珠分选仪分选血管内皮生长因子受体阳性细胞。获得的细胞分诱导组(DMEM,体积分数为0.1的胎牛血清,血管内皮生长因子10μg/L,碱性成纤维细胞生长因子2μg/L)和非诱导组(DMEM,体积分数为0.1的胎牛血清)进行培养。流式细胞仪检测分选前后细胞纯度;噻唑蓝比色法检测诱导组与非诱导组细胞的生长曲线;相差倒置显微镜观察细胞形态;免疫细胞荧光检测细胞vonWillebrand因子和血小板-内皮细胞间黏附分子-1的表达;荧光显微镜观察细胞摄取DiI-ac-LDL的功能;诱导组细胞接种于甲基纤维素半固体培养基进行三维培养,观察形成血管样结构的能力。结果:①细胞纯度:流式细胞仪检测显示未分选的第2代细胞血管内皮生长因子受体阳性率为(8.65±1.47)%,刚分选的血管内皮生长因子受体细胞阳性率(94.06±6.86)%,两者比较差异显著。分选前后的第2代细胞血小板-内皮细胞间黏附分子1阳性率分别为(1.26±0.21)%和(0.57±0.06)%,两者比较差异无显著性。②细胞生长曲线测定:诱导组细胞在诱导培养基中生长良好,第3天进入对数生长期,第6天到平台期。非诱导组细胞生长较慢,第5天进入对数生长期,第8天到平台期。第5天后各时间点差异均显著(P<0.05)。③细胞形态观察:培养12d后,非诱导组细胞为梭形,而诱导组细胞呈“铺路石”样排列。④细胞免疫荧光检测:诱导培养12d后诱导组细胞vonWillebrand因子和血小板-内皮细胞间黏附分子1为阳性,非诱导组细胞皆为阴性。⑤内皮细胞功能检测:诱导后12d后的低密度脂蛋白摄取实验,诱导组细胞内出现红色荧光,非诱导组为阴性。⑥三维培养:诱导组细胞接种在甲基纤维素的半固体培养基内3d后形成“树枝样”分叉结构,未诱导组细胞未形成此类结构。结论:大鼠脂肪组织来源的血管内皮生长因子受体阳性细胞能够诱导分化为成熟内皮细胞。     

荔枝核提取液对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血生化指标的干预实验

目的:通过测定糖耐量变化,分析荔枝核提取液对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠生化指标的干预作用。方法:实验于2005-12/2006-01在右江民族医学院生化教研室完成。①荔枝核,为广西百色市靖西县产酸荔枝果核,晒干后粉碎,水提取,加热煮沸30min后,过滤去渣浓缩,加乙醇沉淀,再过滤去沉淀,加热挥发乙醇,提取,得到含浓度1.2g/mL生药水提液。②选取清洁级健康昆明种小白鼠40只,分为正常对照组、模型对照组、荔枝核提取液低浓度组、荔枝核提取液高浓度组,10只/组。③除正常对照组外,其余各组均按200mg/kg体质量腹腔注射四氧嘧啶水溶液建立糖尿病模型。48h后测血糖,血糖未升高的小鼠按100mg/kg腹腔注射四氧嘧啶水溶液,连续追加2次。③待空腹血糖升高和糖耐量异常后,荔枝核提取液低浓度组用荔枝核水提取液给予灌胃治疗,每只小鼠剂量为0.5mL(内含0.012g荔枝核生药);荔枝核提取液高浓度组每只小鼠剂量为0.5mL(内含0.024g荔枝核生药);正常对照组、模型对照组给予等量蒸馏水灌胃。1次/d,连续7d。④测定造模前后空腹血糖,治疗前后糖耐量血糖,治疗后血清丙氨酸氨基转移酶、尿素、三酰甘油、总胆固醇含量。制备大脑匀浆,测定乙酰胆碱酯酶活性、超氧阴离子自由基(O2-)浓度和清除率、蛋白含量。结果:实验选取健康昆明种小白鼠40只,全部进入结果分析。①造模前后各组小鼠血糖含量的变化:与造模前比较,造模后2,6,9d模型对照组、荔枝核提取液低浓度组、荔枝核提取液高浓度组血糖含量均显著升高,而正常组无明显变化。②治疗前后各组糖耐量试验血糖含量的比较:治疗前30min,与正常对照组比较,其余3组血糖含量均明显升高(P<0.05或P<0.01),显示耐糖量较差。治疗后30min,与正常对照组比较,其余3组血糖含量亦均明显升高(P<0.05或P<0.01)。治疗后2h除模型对照组外,荔枝核提取液低浓度组、荔枝核提取液高浓度组均恢复到治疗前空腹水平。③治疗后各组小鼠血清生化指标的测定结果:荔枝核提取液高浓度组总胆固醇明显高于荔枝核提取液低浓度组、正常对照组;荔枝核提取液高浓度组、荔枝核提取液低浓度组、模型对照组尿素含量均明显高于正常对照组(P<0.01)。④治疗后各组小鼠脑匀浆中生化指标的测定结果:模型对照组乙酰胆碱酯酶活性和O2-浓度均明显高于其他各组(P<0.01),O2-清除率明显低于其他各组(P<0.01),脑蛋白明显低于荔枝核提取液高浓度组(P<0.05)。结论:荔枝核提取液能够明显改善四氧嘧啶糖尿病小鼠大脑胆碱能系统传递功能,加速超氧阴离子自由基的清除率,对血脂和肝、肾功能的保护作用尚不明显。     

Study of sonoporation dynamics affected by ultrasound duty cycle

Sonoporation is the ultrasound-induced membrane porosity and has been investigated as a means for intracellular drug delivery and nonviral gene transfection. The dynamic characteristics of sonoporation, such as formation, duration and resealing of the pores in the cell membrane, determine the process of intracellular uptake of molecules or agents of interest that are otherwise obstructed by the cell membrane barrier. Sonoporation dynamics is also important for postultrasound cell survival. In this study, we investigated the effects of ultrasound duty cycle on sonoporation dynamics using Xenopus oocyte as a model system. Transducer with a center frequency of 0.96 MHz was used to generate pulsed ultrasound of desired duty cycle (5%, 10% and 15%) at a pulse repetition frequency of 1 Hz and an acoustic pressure of 0.4 MPa in our experiments. Employing voltage clamp techniques, we measured the transmembrane current as the direct result of decreased membrane resistance due to pore formation induced by ultrasound application. We characterized the sonoporation dynamics from these time-resolved recordings of transmembrane current to indicate cell membrane status, including pore formation, extension and resealing. We observed that the transmembrane current amplitude increased with increasing duty cycle, while the recovering process of membrane pores and cell survival rate decreased at higher duty cycles.     

自体骨髓干细胞移植治疗慢性下肢缺血94例不同病变分期患者的效果比较

目的：观察自体骨髓干细胞移植对慢性下肢缺血间歇性跛行期、静息痛期、溃疡期和坏疽期患者治疗效果的比较。方法：选取2003-03／2005-02首都医科大学宣武医院收治慢性下肢缺血患者94例（102条患肢），男59例，女35例，年龄平均69．5岁。病因：糖尿病性下肢缺血90条患肢（84例患者），单纯动脉硬化闭塞症7条患肢（6例患者），血栓闭塞性脉管炎5条下肢（4例患者）。间歇性跛行期13条患肢（12例患者）；静息痛期41条患肢（38例患者）；组织缺损期包括溃疡期和坏疽期，分别有26条患肢（24例患者）和22条患肢（20例患者）。①全部患者均行自体骨髓干细胞移植，采用下肢局部肌肉注射、下肢动脉腔内注射、下肢局部肌肉注射和动脉腔内注射同时进行3种方法。下肢局部肌肉注射是将经过分离、提纯的自体骨髓干细胞，采用多点方法注射在患肢缺血部位的肌肉内；下肢动脉腔内注射是将骨髓干细胞注射在下肢动脉腔内，注射时要用球囊导管阻断下肢动脉闭塞处的近端血流，时间3-5min；下肢局部肌肉注射并动脉腔内注射的方法是同时采用前2种方法进行移植。②主要临床症状与体征主观指标的评估：间歇性跛行期根据在正常速度下行走的距离分为5级（0级：行走≥500m，无疼痛；1级：行走400-499m，有疼痛；2级：行走300-399m，有疼痛；3级：行走100-299m，有疼痛；4级：静息痛，无法行走或行走〈100m，有疼痛）。静息痛期根据疼痛与否及疼痛程度分为5级（0级：无疼痛；1级：偶有疼痛，被问及能回忆起；2级：疼痛经常出现但能耐受，不需或偶用一般止痛剂；3级：经常使用一般止痛剂；4级：因疼痛影响睡眠，一般止痛剂难以缓解）。患肢冷感根据患肢有无冷感及冷感的程度分为5级（0级：无冷感；1级：受累肢体偶有发凉、怕冷的感觉；2级：受累肢体经常有发凉、怕冷的感觉；3级：受累肢体明显有冷、凉的感觉#采用局部保温措施后症状能得到一定程度的缓解；4级；受累肢体明显有冷、凉的感觉，采用局部保温措施后症状仍无明显改善）。③主要临床症状与体征客观指标的评估：新生侧支血管评估根据其数量分为4级（0级：无新生侧支血管；1级：少许新生侧支血管；2级：中量新生侧支血管；3级：丰富新生侧支血管）。保肢率以术后2个月为基准，观查各期的截肢率和保肢率。④疗效评估：患肢疼痛、冷感和间歇性跛行未减轻为无变化，减轻1级为改善，减轻2或3级为明显改善，达到0级为症状消失；创面愈合并且疼痛消失为治愈，创面明显缩小为明显改善，刨面缩小为改善，创面及疼痛无变化或扩大为无效。结果：按意向处理分析，纳入实验的94例患者102条患肢全部进入结果分析。①不同患病期的下肢缺血总有效率比较：间歇性跛行期100％，静息痛期92．7％，溃疡期83.3％，坏疽期59．1％。前3期比较基本相近（χ^2=1．01～2．23，P〉0．05）；静息痛期与溃疡期比较仍无差异（χ^2=1．11，P〉0．05）；前3期均显著高于坏疽期（χ^2=10．48，P〈0．01；在5．18，P〈0．05；χ^2=3．93，P〈0．05）。②不同患病期的踝肱指数变化：间歇性跛行期、静息痛期、溃疡期、坏疽期踝肱指数增加分别为46．2％，31．7％，34．6％和27.3％，无明显差异。③不同患病期保肢率：间歇性跛行期100％，静息痛期97．6％，溃疡期88．5％，坏疽期59．1％。前3期比较基本相近（χ^20．32～0．41，P〉0．05）；静息痛期与溃疡期比较也基本相近（χ^2=2．35，P〉0．05）；前3期均显著高于坏疽期（在15．87，P〈0．0l；χ^2=5．18，P〈0．05；χ^2=5．48，P〈0．05）。④不同患病期经皮氧分压增加与血管生成情况：经皮氧分压测定各期之间无明显差异。下肢动脉造影显示，有丰富血管生成的百分比各期之间也没有明显差异。结论：自体骨髓干细胞下肢局部肌肉注射移植治疗下肢缺血患者，在病变的早、中阶段和单纯溃疡阶段，其有效率和保肢率均无明显差异，但以上3阶段的有效率和保肢率均明显高于晚期的有组织坏疽阶段，充分说明自体骨髓干细胞移植特别适合下肢缺血患者病变的早期与中期，对于缺血晚期特别是患肢存在组织坏疽者的治疗效果仍有待进一步提高。