pshuttle-Egr-1-hSmac质粒联合X线照射对乳腺癌MDA-MB-435细胞增殖的抑制作用

目的:构建pshuttle-Egr-1-hSmac质粒并转染人乳腺癌MDA-MB-435细胞,观察其抑制肿瘤细胞的辐射增敏作用。方法：转染pshuttle-Egr-1-hSmac质粒的MDA-MB-435细胞经过2 Gy X线照射不同时间（4、8、12、24 和48 h）和0.5 ~ 5.0 Gy X线照射后24 h收集细胞,采用RT-PCR和Western blotting法检测Smac mRNA及其蛋白表达。将细胞分为对照组、pshuttle质粒组、pshuttle-Egr-1-hSmac 质粒组、2 Gy 组、pshuttle+2.0 Gy组 和pshuttle-Egr-1-hSmac+ 2.0 Gy组,MTT法检测各组细胞增殖;克隆形成实验检测细胞存活能力;Annexin Ⅴ-FITC双染法检测细胞凋亡;PI单染法检测细胞周期。结果:对照组和pshuttle质粒组MDA-MB-435细胞中Smac mRNA无表达,而pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组MDA-MB-435细胞Smac mRNA表达水平随时间延长逐渐升高,于24和48 h时表达水平最高;经0.5 ~ 5.0 Gy X线照射后24 h MDA-MB-435细胞Smac mRNA表达水平随照射剂量增加而逐渐增加,在2.0和5.0 Gy X线照射后Smac mRNA表达水平最高。pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组4、8、12和24 h后Smac蛋白表达水平逐渐升高,24 h后表达水平最高。经过0、0.5、1.0、2.0和5.0 Gy X线照射后24 h Smac蛋白表达水平逐渐升高,尤其以5.0 Gy X线照射时表达水平最高。MTT法检测时程效应,2.0 Gy、pshuttle+2.0 Gy和pshuttle-Egr-1-hSmac+2.0 Gy质粒组24、48和72 h细胞A490值明显低于对照组（P<0.01）;剂量效应,pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组1.0～5.0 Gy X线照射后,MDA-MB-435细胞A490值明显低于0 Gy X线照射(P<0.05或P<0.01)。pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组细胞存活分数明显低于对照组（P<0.01）。pshuttle-Egr-1-hSmac+2.0 Gy组细胞凋亡率明显高于2.0 Gy组（P<0.01）,G0/G1期和S期细胞百分率明显低于2.0 Gy照射组（P<0.01）,G2/M期细胞百分率明显高于2.0 Gy组（P<0.01）。结论：X线照射能增加pshuttle-Egr-1-hSmac质粒转染的MDA-MB-435细胞有效表达Smac mRNA及蛋白,能抑制细胞存活,且诱导G2/M期阻滞和凋亡增加;Smac基因联合放射治疗可明显增加乳腺癌细胞的放射敏感性。     

低剂量电离辐射对糖尿病小鼠肾脏ICAM-1 mRNA和蛋白表达的影响

目的：研究低剂量电离辐射（LDR）对链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病（DM）小鼠肾脏细胞间黏附分子-1（ICAM-1）mRNA及蛋白表达的影响,阐明LDR抗炎作用可能是其治疗糖尿病的主要机制。方法：选取健康适龄C57BL/6J小鼠,分为4组（对照、DM、LDR和DM/LDR组）。其中DM与DM/LDR组经腹腔注射STZ,建立DM模型,另2组给予等量枸橼酸溶液。造模后DM/LDR与LDR组给予25 mGy隔日照射,共照射4周。在照射后2、4、8、12及16周,利用RT-PCR及Western blotting方法检测其肾脏ICAM-1 mRNA及蛋白表达。结果：小鼠造模后照射前各组肾脏总ICAM-1 mRNA及蛋白表达差异无显著性（P>0.05）。给予LDR 2周时DM组肾脏ICAM-1 mRNA及蛋白表达显著高于其他3组（P<0.05）。照射后4周时DM/LDR 组ICAM-1 mRNA表达水平明显高于非DM组（P<0.05）,但仍显著低于DM组,这种差异一直保持到照后16周。而LDR组其表达水平显著高于对照组（P<0.05）。免疫组织化学检测：与非DM组比较,DM组小鼠肾小球、肾小管结构异常,且阳性细胞染色数量明显增多。但DM/LDR组肾小球肾小管损伤较DM组有所减轻,且阳性细胞数量显著少于DM组。结论：在糖尿病状态下LDR能有效降低ICAM-1 mRNA及蛋白表达水平,缓解肾脏的炎症反应;在正常机体LDR可提高免疫力,促进免疫相关因子释放,提示LDR视机体所处不同状态发挥不同的调节功能。     

重组截短型人角质细胞生长因子-1的表达及纯化

目的：构建高效表达N端缺失的23个氨基酸重组人角质细胞生长因子1( rhKGF1_dest23)的基因工程菌,为治疗放化疗后口腔黏膜炎的新药开发提供实验数据。方法：利用PCR方法分别以pET3c-hKGF1及sumo-EGF为模板合成N端缺失的23个氨基酸rhKGF1_dest23及sumo基因片段,构建4种原核表达载体pET22b-rhKGF1_dest23﹑pET22b-sumo-rhKGF1_dest23﹑pET3c-rhKGF1_dest23和pET3c-sumo-rhKGF1_dest23,分别转化原核表达宿主菌Rosetta(DE3) plysS、BL21(DE3) 、BL21(DE3)Star plysS、origima(DE3) 和BL21AI,筛选rhKGF1_dest23蛋白表达的最佳质粒与宿主菌组合。CM离子交换和肝素亲和层析法纯化rhKGF1_dest23蛋白,Western blotting法鉴定rhKGF1_dest23蛋白。结果： pET22b-rhKGF1_dest23质粒与BL21AI 宿主菌为最佳组合表达,经IPTG与阿拉伯糖诱导, SDS-PAGE电泳后表明目的蛋白大部分以可溶性形式存在,约占菌体总蛋白的10％,经CM和肝素两步纯化后rhKGF1_dest23蛋白纯度为95%以上,Western blotting法鉴定为rhKGF1_dest23蛋白。结论：成功构建表达人KGF1_dest23重组蛋白的基因工程菌,经IPTG与阿拉伯糖诱导,CM弱阳离子与肝素亲合层析后,得到了纯化的rhKGF1_dest23蛋白。     

三羟基苯甲酸纯化物及其化合物对Jurkat细胞周期进程及凋亡的影响

目的： 研究不同浓度菱角三羟基苯甲酸（TBA）纯化物及其化合物对人 T淋巴细胞白血病Jurkat细胞周期进程及凋亡的影响,并探讨2种不同来源TBA对肿瘤生长抑制的可能机制。方法： 2种不同来源TBA分别作用于对数生长期的Jurkat 细胞,每种TBA分为5组（0、3.125、6.250、12.500和25.000 mg/L）,作用于Jurkat 细胞30 h后,经流式细胞仪分别检测不同浓度菱角TBA纯化物及其化合物处理的Jurkat 细胞周期各时相及其凋亡率变化。 结果： Jurkat细胞分别经过不同浓度菱角TBA纯化物处理后,细胞凋亡率明显高于0 mg/L组（P<0.05或P<0.01）;与对照组比较,3.125 mg/L组变化无差异;6.250、12.500和25.000 mg?L-1组变化有差异（P<0.05或P<0.01）。Jurkat细胞分别经过不同浓度TBA化合物处理后,与对照组比较,细胞凋亡率在3.125 mg?L-1组时即存在差异（P<0.05）,随其剂量增加而增加（P<0.05 或P<0.01),各用药组间变化无差异。经TBA纯化物作用后,G1期细胞百分数明显高于对照组（P<0.01）,并随TBA剂量增加而增加,在6.250 ~ 25.000 mg/L浓度下S期细胞百分数明显低于对照组（P<0.05或P<0.01）,G2期无显著变化。经TBA化合物作用后在6.250 ~ 25.000 mg/L浓度下G1期百分数明显高于对照组（P<0.05 或P<0.01）,S期细胞百分数明显低于对照组（P<0.05 ）,G2期无显著变化。各用药组间变化无差异。结论： 2种不同来源TBA均能够诱导细胞凋亡;均能够阻止人 T淋巴细胞白血病细胞的 G1期细胞向S期进程,其抑制作用可能通过G0/G1期阻滞引起。     

低剂量电离辐射诱导小鼠睾丸NO含量、NOS活性及AIF基因的变化

目的 研究低剂量电离辐射诱导小鼠睾丸一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)活性及凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)基因的变化。方法 酶法检测不同剂量(0、0.025、0.05、0.075、0.1及0.2Gy)及0.075Gy照射后不同时间(0、3、6、12、18和24h)小鼠睾丸组织中NO含量及NOS活性的变化;Real-time PCR和Western blot法检测不同剂量(0、0.05、0.075、0.1及0.2Gy)及0.075Gy照射后不同时间(0、6、12和24h)小鼠睾丸组织中AIF mRNA表达及蛋白的表达。结果 不同剂量X射线照射后12h,小鼠睾丸组织中NO含量及NOS活性随照射剂量增加而增加,0.075Gy增至最大(P<0.05),0.1~0.2Gy一直维持较高水平(P<0.05);AIF mRNA随剂量增加而增加,0.1Gy时达到最大(P<0.05);而AIF蛋白在0.075Gy时达到最大。0.075Gy X射线照射后,NO含量与NOS活性随时间延长而增加,NO含量在24h时增到峰值(P<0.05),而NOS活性在12h时达到峰值(P<0.05);AIFmRNA随时间延长而增加,在24h时达到峰值(P<0.05);其蛋白表达在12h时达到峰值。结论 低剂量电离辐射照射后,小鼠睾丸生精细胞中NO含量、NOS活性及AIF基因表达增加,具有时程和剂量效应规律性。     

电离辐射联合自噬诱导剂或抑制剂对人宫颈癌Hela细胞的作用

目的 探讨电离辐射联合自噬抑制剂或诱导剂对人宫颈癌细胞株增殖的影响。方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)和流式细胞术(FCM)检测经不同剂量(0、2、4、6、8和10 Gy)照射和6 Gy+自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-MA)及6Gy+自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)不同方法处理的人宫颈癌细胞存活和增殖情况,并分析其量效和时效关系。结果 随着照射剂量的增加(2、4、6、8和10 Gy)及时间的延长(24、48和72 h),宫颈癌细胞增殖的抑制作用组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。6 Gy+rapamycin处理对癌细胞增殖的抑制率低于单纯6Gy照射组(P<0.05),组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。6 Gy+3-MA处理对癌细胞增殖的抑制高于单纯6 Gy照射组(P<0.05),处理后24、48和72 h其抑制率组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 在Hela细胞中电离辐射诱导自噬能够拮抗凋亡,电离辐射联合自噬诱导剂能够抑制Hela细胞凋亡,而电离辐射联合自噬抑制剂能够促进其凋亡。     

有关基因表达及其相关问题

导入的目的基因能否在体内特定组织细胞中表达,稳定还是瞬时表达,表达可否被调控以及表达效率的高低等均受多方面因素的制约,包括基因导入系统、表达调控元件和目的基因本身等。本文主要综述表达系统对目的基因表达的水平、持续时间、顺序和特异性等的调控问题。     

低剂量X射线照射对小鼠肝癌H-22细胞膜相关抗原肽提取物抑瘤作用的影响

目的：观察低剂量X射线照射对小鼠肝癌H-22细胞膜相关抗原肽（TAP）提取物抑瘤作用的影响,为低剂量辐射与肿瘤疫苗联合治疗肿瘤提供实验依据。 方法：采用微酸洗脱法制备分子量≤3 000的细胞膜TAP提取物,皮下免疫小鼠,免疫前12 h给予75 mGy X射线全身照射,检测胸腺细胞周期时相、脾细胞Con A反应性及脾T细胞CD4、CD8亚组的变化,同时观察体内抑瘤效应。 结果：TAP提取物免疫小鼠后,移植肿瘤的发生率降低,平均出现时间延迟,生长速度减慢;脾细胞Con A反应性增强,胸腺细胞周期百分数无显著变化。小鼠免疫前12 h给予75 mGy全身照射可增强TAP提取物的抑瘤效应,与单纯TAP组相比,胸腺细胞S期百分数明显增加,脾细胞CD8+ T细胞百分数增高。 结论：低剂量辐射能进一步激发免疫系统功能,增强小鼠肝癌H-22细胞膜TAP提取物的抑制肿瘤作用。     

抗抑郁药万拉法新的神经保护作用

目的：探讨万拉法新的神经保护作用及其机制。 方法：采用体外原代培养的大鼠海马神经元,复制谷氨酸损伤模型以模拟抑郁症时的病理改变,在体外通过MTT法检测万拉法新对神经元存活率的影响,并且测定万拉法新应用前后LDH的释放、GSH水平、MDA含量和SOD活性的改变情况。 结果：万拉法新抵抗了谷氨酸诱导的神经元损伤,提高了神经元存活率,减少了LDH的释放,维持细胞膜的完整性,提高了神经细胞内SOD活性和GSH水平,降低了MDA含量。 结论：万拉法新具有神经保护作用。     

低剂量电离辐射对雄性糖尿病模型大鼠生殖损伤的影响

目的 探讨75 mGy照射对12周糖尿病(DM)大鼠睾丸生精细胞凋亡及抗氧化和性激素水平的影响。方法 随机将Wistar大鼠分为3组:健康对照组、75 mGy＋DM组及DM组,12周末记录其存活率和体重。采用流式细胞术和TUNEL染色法检测生精细胞凋亡率,应用试剂盒分别检测血清及睾丸抗氧化和激素水平的变化。结果 12周后,DM组大鼠存活率为25%,健康对照组为100%(χ²=15.938, P<0.01);75 mGy＋DM组大鼠存活率为56.25%,与DM组比较差异有统计学意义(χ²=4.00,P<0.05)。糖尿病大鼠生精细胞凋亡率较健康对照组明显增加,亦高于75 mGy+DM组(F＝5.496,P<0.05)。与健康对照组比较,糖尿病大鼠血清和睾丸组织中丙二醛(MDA)及NO含量不同程度增加,而75 mGy＋DM组大鼠血清和睾丸MDA含量显著低于单纯DM组,以睾丸组织中尤为明显(F=10.644,P<0.01);75 mGy照射显著降低了DM组大鼠血清NO含量(F=14.379, P<0.05),同时增加了DM组大鼠血清中的一氧化氮合酶(NOS)活性及睾丸酮(TS)和促滤泡激素(FSH)含量(F值分别为9.676、43.194和5.282,P<0.05或P<0.01)。结论 低剂量辐射显著降低睾丸组织及血清MDA和NO含量,增加抗氧化酶活性和TS及FSH含量,可能与其抑制糖尿病大鼠生精细胞凋亡增多所致生精障碍有关。