消化系肿瘤增殖诱导配体高表达细胞株的筛选

目的 筛选出增殖诱导配体(APRIL)mRNA高水平表达的人消化系肿瘤细胞株,为进一步探讨APRIL基因在消化系统肿瘤发生、发展以及转移过程中的作用机制奠定基础.方法 选择2株人胃癌细胞(AGS、SGC7901)和3株人胰腺癌细胞(PANC1、CFPAC-1、BxPC3)培养提取mRNA后,逆转录成cDNA作PCR模板.以APRIL基因高保守区设计特异性的引物,以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参,PCR扩增目的片段,通过计算机图像扫描系统分析各株细胞的APRIL mRNA的表达量,以表达量最高的1株作为1,获得各细胞株的APRIL mRNA表达量的相对值.结果 5株细胞APRIL mRNA的相对值分别为:AGS,0.09;SGC 7901,0.61;PANC 1,0.45;CFPAC 1,1;BxPC3,0.57,按表达量高低顺序为:CFPAC 1 ＞ SGC 7901 ＞ BxPC3 ＞ PANC 1 ＞ AGS.结论 在不同肿瘤细胞中APRIL的表达有高有低,提示APRIL基因在肿瘤发生、发展过程中起一定作用.     

弓形虫昆山分离株速殖子期表达型cDNA文库的构建及鉴定

目的　构建弓形虫速殖子期表达的基因的完整长度cDNA文库。方法　用CF - 11纤维素柱快速提纯速殖子 ,以盐酸异硫氰酸胍 (AGPC)一步法抽提总RNA ,oligo -dT纤维素分离mRNA后 ,用ClonTech公司的SmartTMPCRcDNA文库构建试剂盒 ,构建了弓形虫昆山分离株的表达型文库。结果　获得 5× 10 6个独立克隆 ,重组率为 99% ,插入片段的平均长度为 1kb。结论　本文库可望用于弓形虫疫苗研究的候选基因的筛选     

我国不同疟区间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)基因多态性研究

目的　了解我国不同疟疾流行区间日疟原虫裂殖子表面蛋白 - 1基因多态性及其分布。方法　用套式PCR扩增间日疟原虫现场分离株MSP - 1第五多态区 (ICB5 -ICB6 )基因片段 ,部分样本进行序列测定、分析和比对。结果　 82份间日疟原虫现场分离株扩增出 4 70bp片段 5 0份 ,4 0 0bp片段 39份 ,其中 7份为两种片段的混合型。海南分离株混合型为 2 0 %(6 / 30 ) ,平均克隆数为 1 2 0 (36 / 30 ) ,安徽分离株混合型仅为 2 3% ,平均克隆数 1 0 2。对 33份样本进行序列测定 ,Sal- 1型17份 ,Belem型 2份 ,12份重组型 (Ⅲ型 )和朝鲜型 2份为我国新发现基因型。结论　我国间日疟原虫PvMSP - 1存在 4种不同的等位基因型 ,以Sal- 1型和重组型 (Ⅲ型 )占优势 ,南部疟区基因型比北部复杂。     

靶向胰腺癌细胞株增殖诱导配体基因小干扰RNA的制备及纯化

目的:制备及纯化针对增殖诱导配体基因(APRIL)的小干扰RNA(APRIL siRNA),为进一步研究APRIL基因在人胰腺癌中的作用奠定基础.方法:构建靶向胰腺癌CFPAC-1细胞株APRIL基因双链RNA(APRIL dsRNA)的表达质粒pET-22b-APRIL, 在大肠杆菌中发酵表达APRIL dsRNA,并利用CF-11树脂亲和层析纯化;用大肠杆菌Ⅲ型RNA水解酶(RNase Ⅲ)水解dsRNA,制备APRIL siRNA,应用DEAE树脂离子交换层析使RNaseⅢ与核苷酸分离,分子筛层析进一步分离纯化APRIL siRNA.将纯化后的APRIL siRNA转染CHO细胞,荧光显微镜下观察转染后CHO细胞APRIL蛋白的表达情况.结果:pET-22b-APRIL转染大肠杆菌后,经IPTG诱导能大量表达APRIL dsRNA,表达产物经CF-11树脂纯化能得到纯化的APRIL dsRNA;dsRNA经RNase Ⅲ水解后,过DEAE树脂离子交换层析柱,经5%PAGE、12%SDS-PAGE电泳证实RNase Ⅲ与核苷酸分离,进一步经分子筛层析分离纯化,得到纯化APRIL siRNA.荧光显微镜下观察结果表明,APRIL siRNA转染CHO细胞能明显抑制APRIL蛋白的表达.结论:成功制备了靶向CFPAC-1细胞株的APRIL siRNA,为下一步敲减CFPAC-1细胞APRIL基因的研究奠定了基础.     

VEGF特异siRNA对骨肉瘤细胞凋亡和仿血管发生的影响

目的：探讨VEGF特异siRNA在骨肉瘤细胞株（MG63）增殖、凋亡以及仿血管发生中的作用。方法：以pSilienc-er载体构建VEGF特异siRNA质粒pSilencer-VEGF siRNA,并转染骨肉瘤细胞MG63;将细胞分为pSilencer-VEGF siRNA质粒组（试验组）和空siRNA质粒组（对照组）,Western blotting在蛋白水平检测转染重组质粒后MG63细胞VEGF表达情况;MTT比色法、光镜、流式细胞仪结合Annexin V-FITC/PI染色和H-E染色观察质粒转染后骨肉瘤细胞增殖、凋亡和仿血管发生情况。结果：测序证实成功构建了针对VEGF的siRNA重组质粒。转染pSilencer-VEGF siRNA重组质粒后的试验组培养液中及骨肉瘤细胞内VEGF蛋白表达下降;转染后48、72、96h骨肉瘤细胞的增殖抑制率分别为41.67%、43.92%、35.32%,并发生了早期凋亡,凋亡率为28.27%。转染pSilencer-VEGF siRNA重组质粒的骨肉瘤细胞未见仿血管发生,转染空质粒的对照组骨肉瘤细胞则有仿血管发生。结论：RNA干扰VEGF基因能抑制骨肉瘤细胞增殖,促进骨肉瘤细胞早期凋亡,干扰骨肉瘤细胞仿血管发生,为临床基因治疗骨肉瘤提供了新的思路。     

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1重组嵌合抗原免疫血清的制备与鉴定

目的 制备与鉴定弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（P30）重组嵌合抗原的特异性免疫兔血清。 方法 将已构建的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus（DE3）-RIL菌株，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后，分离上清液和包涵体，包涵体用2 mol/L和4 mol/L尿素梯度洗涤去杂蛋白，最后用8 mol/L尿素溶解洗涤后的包涵体，进行十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），割胶回收目的蛋白，研磨成乳浊状后以背部多点注射免疫大白耳兔，制备免疫兔血清，以免疫扩散试验检测生成的特异性抗体，间接ELISA法测定免疫血清的抗体效价，蛋白质印迹（Western blotting）分析免疫血清的抗体特异性。 结果 免疫结束后，通过对流免疫扩散试验检测到了针对rROP2-P30的特异性抗体，间接ELISA法测定到其抗体滴度最高可达1 ∶ 12 800，Western blotting分析结果表明，此免疫血清与可溶性的重组蛋白、包涵体形式的重组蛋白均能特异性结合。 结论 得到了针对rROP2-P30重组嵌合抗原的特异性免疫血清。     

PKB的PH结构域在原核表达及其纯化和活性

目的　利用原核系统表达原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶B(PKB)的PH结构域 ,为进一步研究其结构和功能奠定基础。方法　我们构建了PKB的PH结构域的表达质粒 ,在大肠杆菌中表达出PH结构域 ,并利用蛋白N端加入的组氨酸标签进行亲和层析及离子交换层析纯化蛋白。结果　在大肠杆菌中表达的PH结构域以包涵体形式存在 ,经变性和复性后成为具有天然构象的可溶性蛋白 ,经亲和层析和离子交换层析纯化的PH结构域具有与磷脂酰肌醇PI 4 ,5 P2 的结合能力 ,证明其具有生物学活性。结论　本方法成功表达纯化了PKB的PH结构域 ,可用作PH结构域结构和功能的进一步研究。     

人重组FL对淋巴瘤和白血病细胞株的体外作用研究

目的：探讨ＦＬ对淋巴瘤与白血病细胞株的体外作用。方法：采用ＭＴＴ法检测不同浓度的人重组ＦＬ对一系列淋巴瘤和白血病细胞的体外生长作用。结果：ＦＬ对ＨＬ６０,Ｒａｊｉ 及Ｅｃｖ（ 人内皮细胞株） 细胞有一定的促进增殖作用,而对其它大多数淋巴瘤和白血病细胞无明显的效应。结论：人重组ＦＬ刺激内皮细胞的增殖可能在造血和炎症的病理过程中起直接或间接作用,从而为ＦＬ的临床运用提供一定的理论依据。     

弓形虫RH株速殖子期表达型cDNA文库的构建及鉴定

为构建弓形虫速殖子期表达的基因的完整长度cDNA文库 ,用CF 11纤维素柱快速提纯速殖子 ,以盐酸异硫氰酸胍 (AGPC)一步法抽提总RNA ,oligo dT纤维素分离mRNA后 ,用ClonTech公司的SmartTMPCRcDNA文库构建试剂盒 ,构建了弓形虫RH株的表达型文库。获得 5× 10 6个独立克隆 ,重组率为 99% ,插入片段的平均长度约为 1kb。根据已知序列设计引物 ,从cDNA文库中扩增出编码棒状体蛋白 1(ROP1)的基因 (不含编码信号肽的序列 ) ,本文库可望用于弓形虫疫苗研究的候选基因的筛选。     

RNAi抑制骨肉瘤细胞KDR蛋白表达的研究

目的研究siRNA表达载体对骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白表达的抑制作用。方法构建psuper质粒,化学合成2段编码发卡RNA序列、靶向KDR基因的寡核苷酸,克隆进pSuper的pol Ⅲ HI启动子的下游,重组构建抑制KDR表达的siRNA质粒,并转染入骨肉瘤MG63细胞,Western blot检测转染后KDR基因在蛋白水平表达的变化。结果酶切后电泳鉴定正确的重组质粒小量扩增后测序,证实成功构建了KDR siRNA表达质粒,转染入细胞后,有效抑制了KDR基因在蛋白水平的表达。结论成功构建的siRNA表达载体有效抑制了骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白的表达,为进一步分析骨肉瘤中KDR基因的功能及肿瘤治疗奠定了研究基础。