脑脊液可溶性白细胞介素2受体测定对中枢神经系统白血病的诊断价值

可溶性白细胞介素2受体(Solubleinterleukin-2recepter,sIL-2R),自1985年被发现以来已受到临床工作者的广泛关注。已有证据表明,急性白血病(AL)患者血清sIL-2R水平明显升高,且其水平的变化与疾病的发展和转归有一定的关系[1、2]。但脑脊液(CSF)sIL-2R在中枢神经系统白血病(CNSL     

sTNFR Ⅰ基因修饰的未成熟树突细胞对异基因骨髓移植小鼠移植物抗宿主病和移植物抗白血病作用的研究

目的 探讨可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ (sTNFR Ⅰ)基因修饰的未成熟树突细胞(DC)对白血病小鼠异基因骨髓移植(allo-BMT)后移植物抗宿主病(GVHD)和移植物抗白血病(GVL)效应的影响及其机制.方法 以BALB/c(H-2d)小鼠为供鼠,C57 BL/6( H-2b)小鼠为受鼠,建立小鼠T细胞白血病BMT模型.受鼠全身照射(TBI)后4h内,将供鼠骨髓细胞和脾细胞按1:1混合,经尾静脉输注于受鼠体内,同时输注T细胞白血病/淋巴瘤细胞株EL4细胞.实验分组:①A组:单纯照射组;②B组:白血病发病组;③C组:allo-BMT组(移植物未做任何处理);④D组:pXZ9-DC组(未经修饰的未成熟DC组);⑤E组:sTNFR Ⅰ -DC组(sTNFR Ⅰ修饰的未成熟DC组).观察移植小鼠GVHD典型症状、病理分级、白血病细胞浸润情况、存活时间、生存率等,采用ELISA法测定IFN-y和IL-4浓度,采用流式细胞术( FCM)检测异基因嵌合率.结果①A组小鼠均于10 d内死于骨髓衰竭.B组小鼠均死于淋巴瘤/白血病.C组小鼠出现明显急性GVHD表现,而D组和E组小鼠只有部分出现GVHD表现,且GVHD评分及病理表现均较C组明显减低或减轻(P值均＜0.05),其中E组小鼠GVHD评分较C和D组均降低(P值均＜ 0.05),病理学改变最轻.C、D和E组小鼠存活时间分别为(11.50±3.50)、(21.70 ±5.80)和(25.80±5.20)d,D、E组小鼠存活时间均较C组明显延长(P值均＜0.05),其中E组小鼠平均存活时间最长.B组小鼠18 d内均死于白血病,C、D和E组小鼠白血病的发病率分别为10％、20％、10％,各组发病率比较差异无统计学意义(P＞0.05).②移植后C、D和E组小鼠血清IFN-y浓度在+12 d时达高峰,后逐渐下降,+18 d时IFN-(y)的浓度E组较C和D组降低(P＜0.05),D组较C组低(P＜0.05).C组小鼠血清IL-4降低,而D和E组浓度渐升高,+12 d达高峰,三组间两两比较差异均有统计学意义(P值均＜0.05).③+30 d,C、D和E组存活受鼠骨髓异基因嵌合率为95％ ～ 100％,证实为完全供鼠型植入.结论 未成熟DC可诱导allo-BMT免疫耐受,输注sTNFR Ⅰ基因修饰的未成熟DC可延长移植小鼠的存活时间,在一定程度上减轻GVHD的同时又保留GVL效应.     

物理诊断学教学实践与体会

针对物理诊断学特点,结合实际工作,通过改进教学方法、改革考试方式等加强学生技能训练及临床思维培养,提高物理诊断学教学质量.     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达

背景:趋化因子受体7(chemokine receptor-7,CCR7)是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。目的:构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法:采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒(重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒ΔNRF及包膜质粒pVSVG)共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。结果与结论:实验成功扩增出小鼠CCR7DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293FT细胞后,24h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。     

CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞的诱导培养及鉴定

背景:新近发现CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞在参与免疫负向调控机制和临床治疗上有潜在的意义。目前对于健康人骨髓来源的调节性树突状细胞的体外诱导培养及鉴定的研究较少。目的:体外培养正常人骨髓来源的具有CD11clowCD45RBhigh表型的调节性树突状细胞,从细胞形态、免疫表型、吞噬功能及刺激T淋巴细胞增殖能力等方面对其进行鉴定。方法:分离正常人骨髓单个核细胞分别在不同的培养体系中进行体外诱导培养,实验分3组:①调节性树突状细胞组,在含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1的1640培养基中培养7d后,用脂多糖刺激24h。②未成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养8d。③成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养7d后,予脂多糖刺激24h,使其成熟。光镜和扫描电镜观察树突状细胞的形态,流式细胞仪检测其免疫表型以及吞噬能力,CCK-8法检测其刺激异基因淋巴细胞增殖能力。结果与结论:①人骨髓源单个核细胞在联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1培养8d后获得的细胞具有调节性树突状细胞的典型特征和免疫表型,说明该实验建立的培养调节性树突状细胞的方法是切实可行的。②CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞这种新亚群具有较强的吞噬能力,刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱,为调节性树突状细胞诱导免疫耐受的进一步研究奠定实验基础。     

慢病毒介导的sTNFR1在小鼠骨髓未成熟树突状细胞的表达

摘要 背景：未成熟树突状细胞 (imDC) 能够诱导免疫耐受,如何维持DC在未成熟状态是关键,TNF-α是介导DC成熟的重要细胞因子之一,可溶性肿瘤坏死因子受体1 (sTNFR1) 与TNF-α结合可阻断TNF-α的作用,维持DC于不成熟状态。 目的：构建含有人sTNFR1的慢病毒表达载体,观察其在imDC中的表达,为进一步研究imDC在骨髓移植免疫耐受中的作用奠定基础。 设计、时间及地点：开放性实验于 2007-12/2009-06 在徐州医学院附属医院血液病研究室完成。 材料：293FT包装细胞株、包装质粒ΔNRF、被膜蛋白质粒pVSVG、pXZ208由本实验室构建保存。克隆载体pCR2.1为美国Invitrogen公司产品。DC培养的各种单克隆抗体等。成年雄性C57BL/6小鼠购自徐州医学院实验动物中心。 方法：1. 以人外周血MNC总RNA为模板,RT-PCR扩增出sTNFR1基因片段,亚克隆至慢病毒转移质粒pXZ208,通过IRES连接EGFP报告基因,建立双顺反子慢病毒转移质粒,命名为pXZ9-sTNFR1,DNA测序鉴定。采用脂质体转染293 FT细胞,根据报告基因EGFP测定病毒滴度。 2.采用小剂量GM-CSF + IL-4体外扩增培养C57BL/6小鼠骨髓来源的DC,于培养第5 d,用pXZ9- sTNFR1重组慢病毒上清感染imDC,同时以pXZ9病毒作为对照,流式细胞术评估感染效率,RT-PCR检测感染后imDC中sTNFR1的转录,Western blot法检测 sTNFR1蛋白在imDC细胞和培养上清中的表达。观察骨髓来源的DC成熟过程中的表型变化,以及sTNFR1基因修饰DC及外源性脂多糖 (LPS) 刺激后的表型特征。 主要观察指标：重组表达载体pXZ 9-sTNFR1的酶切鉴定。慢病毒的包装及病毒滴度测定。sTNFR1基因转染imDC后sTNFR1的表达及sTNFR1基因修饰DC的表型特征。 结果：1. 成功构建重组质粒 pXZ9-sTNFR1,转染293 FT细胞12 h后在荧光显微镜下观察到EGFP表达,48 h、72 h 和96 h收集病毒上清,病毒滴度为106 U/L以上,获得携带sTNFR1基因的重组慢病毒 pXZ9-sTNFR1。2. 流式细胞术检测病毒上清对imDC感染效率达 (61.37±5.48) %。RT-PCR检测到sTNFR1的表达,Western blot法检测到sTNFR1蛋白存在于感染后imDC细胞的培养上清中,而对照组未检测到sTNFR1的转录和表达。3. 小鼠骨髓MNC在培养4 d 左右出现半黏附细胞集落,集落逐渐增多、变大,第5 d的DC低表达CD40、CD86、CD80和MHCⅡ类分子,第8 d时高水平表达MHCⅡ类分子和CD40、CD86、CD80分子,在LPS的刺激下,Day-7-DC或pXZ-DC 表达高水平MHCⅡ类分子和CD40、CD80、CD86分子,显示出成熟型DC 的表型特征,而sTNFR-DC 的MHCⅡ类分子和CD40、CD80、CD86 分子的表达水平变化不明显。 结论：1. 成功构建了负载sTNFR1基因片段及含EGFP报告基因的慢病毒载体,获得了高滴度的重组慢病毒颗粒。2. 经慢病毒高效转导imDC后sTNFR1的mRNA及蛋白稳定地表达,sTNFR1可以保护imDC不被外源性LPS 刺激所活化,维持DC于非成熟型状态。     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达**

背景：趋化因子受体7(chemokine receptor-7, CCR7)是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。 目的：构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。 方法：采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7 DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒(重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒     ΔNRF及包膜质粒pVSVG)共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。 结果与结论：实验成功扩增出小鼠CCR7 DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293 FT细胞后,24 h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108 U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。 关键词：趋化因子受体7;未成熟树突状细胞;慢病毒载体;真核表达;组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.01.029     

慢性粒细胞性白血病抗原负载树突状细胞激发抗白血病作用

目的研究慢性粒细胞性白血病(CML)细胞冻融抗原(CLA)负载的树突状细胞(DC)对特异性抗白血病T细胞的作用.方法将CML患者外周血单个核细胞(PBMNC)来源的DC在体外用CLA负载,再与CML患者的经细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共同培养,应用乳酸脱氢酶(LDH)释放法观察其对自身CML细胞杀伤活性(A组),与未负载的DC+CIK(B组)、CIK(C组)及CIK+CLA(D组)进行比较.结果效靶比为10∶1条件下,A、B、C、D4组的杀伤活性分别为(63.69±8.35)%、(45.02±5.49)%、(27.28±4.64)%、(29.63±5.71)%.A组比B组杀伤活性强(P＜0.01);C组与D组比无显著性差异.结论CLA负载的DC可进一步提高DC介导的特异性抗白血病T细胞对CML细胞的杀伤活性.     

异基因造血干细胞移植后发生胃肠道急性移植物抗宿主病的危险因素分析

目的 探讨异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)后发生胃肠道急性移植物抗宿主病(gastrointestinal acute graft-versus-host disease, GI-GVHD)的临床特征、相关危险因素和预后情况。方法回顾性分析2017年1月~2020年7月在徐州医科大学附属医院行allo-HSCT的201例患者的临床资料,根据GI-GVHD发生情况进行分组。单因素Logistic回归分析评价GI-GVHD发生的相关因素,多因素Logistic回归分析评价其发生的独立危险因素,进一步分析GI-GVHD对生存及预后的影响。结果 接受allo-HSCT的201例患者中,36例(17.9%)发生GI-GVHD,发生中位时间为34(9～88)天,中位生存时间为228(21～1759)天,总体生存率为36.1%。随访中发生GI-GVHD患者的总生存期(overall survival, OS)较未发生者明显降低(36.1% vs 75.0%),差异有统计学意义(P=0.004)。GI-GVHD患者以持续性恶心、呕吐、腹痛、腹泻和消化系统出血等症状为主,常伴有皮肤、肝脏等靶器官的损害。单因素Logistic回归分析结果显示,供受者性别关系(P=0.012)、移植类型(P=0.054)、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)位点不合程度(P=0.015)、预处理期间使用碳青霉烯类抗生素(P=0.029)、预处理期间使用碳青霉烯类超过7天(P=0.007)、早期血流感染(bloodstream infection, BSI,P=0.023)是GI-GVHD发生的影响因素。多因素Logistic回归分析结果显示,女性供男性(P=0.009,OR=8.866)、非亲缘不全相合移植(P=0.043,OR=16.532)、预处理期间使用碳青霉烯类超过7天(P=0.023,OR=0.079)、早期BSI(P=0.008,OR=0.165)是影响GI-GVHD发生的独立危险因素。受者年龄、疾病类型、有否基础疾病、移植物类型、移植时长、预处理方案中是否加用抗胸腺细胞球蛋白(antithymocyte globulin, ATG)、GVHD预防方案、回输单个核细胞(mononuclear cell, MNC)及CD34⁺细胞数量、粒系和巨核系重建时间、发生其他类型的GVHD等均不是GI-GVHD发生的危险因素。生存分析结果显示,GI-GVHD组患者较非GI-GVHD组患者OS明显降低(36.1% vs 75.0%),差异有统计学意义(P=0.004)。结论 女性供男性、非亲缘不全相合移植、预处理期间碳青霉烯类治疗超过7天和早期发生BSI可能是导致GI-GVHD发生的主要危险因素,移植后发生GI-GVHD的患者生存率会降低。